本文選題：韋榮菌 + 蘋果酸脫氫酶�。� 參考：《吉林大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：殊異韋榮菌（Veillonella dispar）是口腔中一種常見的革蘭陰性厭氧小球菌，是較早定植于牙菌斑中的常駐菌。蘋果酸脫氫酶（Malatedehydrogenase，MDH）在殊異韋榮菌代謝產(chǎn)酸的過程中起到調(diào)節(jié)作用，對齲病的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。在這個實驗中，以殊異韋榮菌為研究對象，對它的蘋果酸脫氫酶基因進行克隆及重組表達，并對其重組蛋白進行純化及活性測定，為蘋果酸脫氫酶在齲病診斷和治療中的作用奠定基礎(chǔ)。 在本實驗的第一部分中，提取殊異韋榮菌基因組DNA，并通過PCR聚合酶鏈式反應(yīng)擴增MDH基因序列，將PCR產(chǎn)物和pET-28a-c(+)載體進行EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切，并用T4DNA連接酶將其連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，，經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切和PCR鑒定，并進行測序驗證。PCR擴增產(chǎn)物特異，全長1139bp。測序結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析，包含MDH基因及其前后片段，通過基因序列和氨基酸分析證明其具有完整的閱讀框架，該基因序列已經(jīng)登陸GenBank，序列號為KC421072。在本實驗第二部分中，將鑒定正確的重組質(zhì)粒MDH-pET-28a-c(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進行重組表達，并對其表達條件進行優(yōu)化。重組質(zhì)粒MDH-pET-28a-c(+)成功的在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，其表達的重組蛋白大約為36kb。經(jīng)過設(shè)置不同誘導(dǎo)劑濃度梯度、相同誘導(dǎo)時間以及不同誘導(dǎo)時間梯度、相同誘導(dǎo)劑濃度成功的得出重組質(zhì)粒MDH-pET-28a-c(+)在大腸桿菌BL21(DE3)中的最佳誘導(dǎo)表達條件為IPTG終濃度為0.5mmol/L,37℃誘導(dǎo)6h，并經(jīng)過超聲破菌鑒定其表達形式為可溶性蛋白。最后對重組蛋白進行高效表達，并對其進行純化和活性測定，其活性測定值為0.4403U/ml。 本實驗成功克隆出殊異韋榮菌蘋果酸脫氫酶基因MDH并通過基因序列和氨基酸分析證明其具有完整的閱讀框架。獲得了重組表達MDH蛋白的最佳表達條件，并測出了蘋果酸脫氫酶的活性，這為進一步研究蘋果酸脫氫酶提供了條件，為研究蘋果酸脫氫酶在齲病的診斷和治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Veillonella dispar is a common gram-negative anaerobic micrococcus in oral cavity. Malate dehydrogenase (MDH) plays an important role in the metabolic process of acid production by isoveronium, and plays an important role in the occurrence and development of caries. In this experiment, the malate dehydrogenase gene was cloned and expressed, the recombinant protein was purified and its activity was determined. To lay a foundation for the role of malate dehydrogenase in the diagnosis and treatment of caries. In the first part of this experiment, we extracted the genomic DNA of E. heterovaronis and amplified the MDH gene sequence by PCR polymerase chain reaction. The PCR product and pET-28a-c () vector were digested with EcoR 鈪

本文編號：2086474