本文選題：脈沖電磁場(chǎng) + 骨結(jié)合　； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：種植體/骨界面反應(yīng)是指在種植體植入至功能負(fù)重后，種植體表面和骨之間以及鄰近骨組織進(jìn)行的一系列骨形成、骨吸收和骨改建的過(guò)程。種植體的成功與否取決于種植體/骨界面的結(jié)合方式，上世紀(jì)七十年代Br nemark教授提出了骨結(jié)合理論。骨-種植體的骨結(jié)合是代謝活躍的骨組織和具有生物相容性的異質(zhì)材料的結(jié)合，以及在后續(xù)功能負(fù)載條件下的持續(xù)的結(jié)合狀態(tài)。在眾多異質(zhì)材料中，鈦及鈦合金種植體在臨床應(yīng)用過(guò)程中取得了良好的成功率，因而鈦及鈦合金成為目前應(yīng)用最為廣泛的種植體材料。然而這類(lèi)種植體依然存在兩大主要問(wèn)題：首先種植體植入體內(nèi)后通常需要3-6個(gè)月的愈合期；其次一些全身因素，如骨質(zhì)疏松、糖尿病、口干癥以及放射治療都會(huì)影響種植體的骨結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致種植體成功率和存在時(shí)間的下降。在骨科和口腔種植等重建性治療領(lǐng)域，快速牢固的骨結(jié)合可以擴(kuò)大適應(yīng)證范圍，提高種植體的成功率，縮短臨床負(fù)載前的等待時(shí)間。因此，如何獲得快速且有效的骨/種植體結(jié)合對(duì)于生物材料領(lǐng)域是一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。眾多學(xué)者致力于研究提高種植體骨結(jié)合的策略，，其中包括種植體表面改性、藥物緩釋系統(tǒng)及輔助療法的應(yīng)用等。生物物理性刺激作為一種有效提高種植體周?chē)前l(fā)生和骨沉積的物理輔助療法，近年來(lái)得到了廣泛的重視。 PEMF全稱(chēng)低強(qiáng)度脈沖電磁場(chǎng)，它是一種新興的非電離，不產(chǎn)熱，非接觸的物理治療手段，這種療法安全可靠，在骨、軟骨相關(guān)疾病治療領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。PEMF應(yīng)用于常規(guī)手段治療效果較差的骨、軟骨相關(guān)疾病，如骨折延遲愈合、骨不連、骨質(zhì)疏松等，能取得良好的效果；其已被FDI批準(zhǔn)，成為促進(jìn)骨組織、軟骨組織愈合的重要輔助療法。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在電磁場(chǎng)中可以觀察到骨組織物理應(yīng)力的改變，這些改變加速了骨微結(jié)構(gòu)的生成和代謝；同時(shí)PEMF在組織中形成的微小磁場(chǎng)有利于骨組織的愈合，同時(shí)能減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生。目前認(rèn)為PEMF促進(jìn)骨修復(fù)的機(jī)制在于其有效促進(jìn)了成骨細(xì)胞的活性。盡管有眾多研究證實(shí)PEMF有顯著地促成骨作用，然而對(duì)于PEMF在種植體表面的成骨作用研究較少。近年來(lái)，一些學(xué)者開(kāi)始研究PEMF對(duì)于種植體骨結(jié)合的影響，結(jié)果提示，PEMF能有效促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)種植體的骨結(jié)合。然而，這些研究大多是動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的對(duì)比研究或有效參數(shù)的篩選，而對(duì)于PEMF影響種植體骨結(jié)合機(jī)制的探索并不深入。本課題旨在研究：（1）PEMF如何影響鈦種植體表面成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化等生物學(xué)行為；（2）PEMF對(duì)于不同類(lèi)型種植體表面（Flat、Micro和Nano）上成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響是否也不相同；（3）PEMF如何影響種植體表面成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，并初步探討PEMF影響成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的信號(hào)通路。 第一部分，不同形貌鈦試件的制備及PEMF的參數(shù)篩選 電磁場(chǎng)刺激對(duì)于不同的細(xì)胞存在不同的參數(shù)窗口，本部分內(nèi)容對(duì)PEMF作用于不同形貌鈦試件表面成骨細(xì)胞的脈沖強(qiáng)度、頻率等參數(shù)進(jìn)行了篩選。首先制備了三種鈦材料表面，分別為機(jī)械拋光組（Flat）、酸蝕噴砂組（Micro）和陽(yáng)極氧化組（Nano）。分別置于對(duì)照無(wú)電磁場(chǎng)刺激（control）和8組不同參數(shù)的電磁場(chǎng)刺激下，研究材料表面原代成骨細(xì)胞的增殖情況。而后選取了1Hz和15Hz兩種頻率的脈沖模式和0.1mT，0.5mT，1mT和5mT四組強(qiáng)度參數(shù)進(jìn)行參數(shù)組合篩選。結(jié)果提示三種材料表面PEMF對(duì)于成骨細(xì)胞作用的 效應(yīng)窗口‖存在一定差異，在后續(xù)試驗(yàn)中選用對(duì)三種材料表面成骨細(xì)胞均有明顯效應(yīng)的15Hz、1mT的電磁場(chǎng)參數(shù)進(jìn)行研究。 第二部分，PEMF對(duì)不同形貌鈦表面成骨細(xì)胞粘附增殖分化的影響 本部分采用蛋白吸附、熒光染色、MTT、ALP染色、茜素紅染色等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)PEMF影響材料表面成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化進(jìn)行系統(tǒng)性研究。還采用了場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡對(duì)材料表面的細(xì)胞微形態(tài)進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明PEMF組三種試件表面蛋白粘附數(shù)量與相應(yīng)對(duì)照組相比都明顯提高。在0.5h時(shí)，盡管三組材料在PEMF刺激下細(xì)胞早期粘附量與對(duì)照組相比都有一定程度的提高，但是并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在1h和1.5h時(shí)，三組材料在PEMF刺激下細(xì)胞早期粘附量與對(duì)照組相比顯著增多（p0.05）。SEM和CLSM觀察結(jié)果提示，在PEMF作用下，成骨細(xì)胞顯示出不同的顯微結(jié)構(gòu)和定向分布，但是物理學(xué)刺激并沒(méi)有影響成骨細(xì)胞在不同材料表面的偽足形式，其中Nano表面主要表現(xiàn)為板狀偽足，而Flat和Nano表面主要表現(xiàn)為絲狀偽足。在PEMF作用下，成骨細(xì)胞呈現(xiàn)與電磁場(chǎng)方向垂直的分布特征，并且成骨細(xì)胞內(nèi)部可觀察到更多的細(xì)胞微絲和應(yīng)力纖維；相反，對(duì)照組大多數(shù)細(xì)胞并沒(méi)有展示出有序排列或者高度分化的細(xì)胞骨架。細(xì)胞增殖結(jié)果提示在4d和7d時(shí)，PEMF刺激組三種表面的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組，其中Nano/PEMF組的與Nano/Control組相比增長(zhǎng)最為明顯，增加了135%。Flat和Micro組在經(jīng)過(guò)PEMF和對(duì)照處理至7d時(shí)，ALP的活性并沒(méi)有顯著差異，但是14d時(shí)，PEMF處理組的成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）較對(duì)照組顯著增加。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEMF在早期促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖而在晚期促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。 第三部分，PEMF對(duì)不同形貌鈦表面成骨相關(guān)基因、蛋白的影響 本部分主要對(duì)成骨相關(guān)的關(guān)鍵基因和蛋白進(jìn)行了分析。PEMF上調(diào)了成骨相關(guān)基因alp、ocn、bmp2、col-1、runx2和osx基因的表達(dá)水平。其中bmp2是對(duì)PEMF刺激最為敏感的基因，4d和7d時(shí)PEMF均促進(jìn)了bmp2基因的上調(diào)，4d時(shí)三組材料分別上調(diào)了0.9倍(Flat)、1.6倍(Micro)和1.7倍(Nano)；7d時(shí)分別上調(diào)了1.6倍(Flat)、1.9倍(Micro)和3.1倍(Nano)，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清的分泌型BMP-2的含量，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4d后，PEMF處理組在Micro和Nano表面上成骨細(xì)胞BMP-2分泌量與對(duì)照組相比顯著提高（p0.05），在Flat表面經(jīng)PEMF處理后，BMP-2分泌量與對(duì)照組相比有一定提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；培養(yǎng)7d后，PEMF處理組在三種表面上成骨細(xì)胞BMP-2分泌量與對(duì)照組相比均顯著提高（p0.05）。而后檢測(cè)了BMP2/Smad通路上的重要蛋白，PEMF刺激后活化的p-Smad1/5/8含量升高，下游蛋白R(shí)unx-2和OSX的蛋白表達(dá)量也有所提高。而加入Noggin抑制劑后，活化的p-Smad1/5/8含量明顯降低， Runx-2和OSX的蛋白表達(dá)量也有所減低。這一結(jié)果強(qiáng)烈提示我們，PEMF對(duì)純鈦試件表面成骨細(xì)胞增殖、分化的影響可能是通過(guò)BMP/Smad信號(hào)通路發(fā)揮作用。 本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)脈沖電磁場(chǎng)能促進(jìn)不同表面形貌鈦材料（Flat、Micro、Nano）上成骨細(xì)胞的成骨活性，表現(xiàn)在PEMF可顯著增加蛋白吸附，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦表面的粘附，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)更多的微絲和應(yīng)力纖維形成，PEMF能促進(jìn)純鈦表面成骨細(xì)胞的增殖和分化，上調(diào)了成骨相關(guān)基因的表達(dá)，而這一過(guò)程可能是通過(guò)BMP/Smad信號(hào)通路發(fā)揮作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，PEMF對(duì)三種不同形貌的鈦材料表面成骨細(xì)胞的成骨活性促進(jìn)程度存在差異，提示不同種植體表面形貌和PEMF刺激對(duì)成骨細(xì)胞的成骨活性可能存在協(xié)同作用。
[Abstract]:Implant / bone interface reaction refers to a series of bone formation , bone resorption and bone remodeling processes between implant surface and bone and adjacent bone tissue following implantation of implant to function . The success of implant depends on the combination of implant / bone interface . In many heterogeneous materials , titanium and titanium alloy are the most widely used implant materials .
Second , some systemic factors , such as osteoporosis , diabetes , xerostomia and radiotherapy , affect the bone union of implants , which leads to the reduction of implant success rate and time .

PEMF is an emerging non - ionizing , heat - free , non - contact physical therapy , which is safe and reliable , and is widely used in the treatment of bone and cartilage related diseases . PEMF is used in the treatment of bone and cartilage related diseases such as fracture delayed union , bone fracture , osteoporosis and so on .
It has been approved by FDI as an important auxiliary therapy for promoting the healing of bone tissue and cartilage . Some scholars have found that the changes of physical stress of bone tissue can be observed in electromagnetic field , which accelerate the formation and metabolism of bone microstructure ;
In recent years , some scholars have begun to study the effect of PEMF on implant bone union .
( 2 ) The influence of PEMF on the biological behavior of osteoblasts on different types of implant surface ( Flat , Micro and Nano ) was different .
( 3 ) How PEMF affects the expression of bone - related genes and proteins on the surface of implants , and preliminary studies on the signal pathways of PEMF on the biological behavior of osteoblasts .

First part , preparation of titanium test piece with different morphology and parameter selection of PEMF

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本文編號(hào)：2037043