本文選題：先天性唇腭裂 + 染色體微陣列分析��； 參考：《廣州醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的 1、探討全基因組高分辨率染色體微陣列技術(shù)(chromosome microarrayanalysis, CMA)在先天性唇腭裂畸形患者中的應(yīng)用價(jià)值。 2、探討CMA技術(shù)在單純性唇裂(isolated cleft lip, CL)、單純性腭裂(isolated cleftpalate, CP)以及唇腭裂（cleft lip with palate,CLP）患者之間其致病性拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNVs)檢出率的差異性。 3、為建立先天性唇腭裂畸形的遺傳學(xué)診斷以及產(chǎn)前診斷的臨床操作流程提供理論依據(jù)。 4、為探討應(yīng)用CMA技術(shù)在先天性唇腭裂畸形遺傳學(xué)診斷及咨詢(xún)中如何最大程度減少臨床意義不明確的CNVs（variants of unknown significance,VOUS）結(jié)果解釋困惑的策略提供實(shí)驗(yàn)室支持。 方法 1、選取自2012年8月至2013年8月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科確診、并接受手術(shù)矯正治療的各種類(lèi)型先天性唇腭裂畸形、伴或不伴發(fā)其他畸形的臨床患兒共計(jì)33例核心家系樣本：非綜合癥型唇腭裂患兒29例，包含了單純性CL患兒10例，單純性CP患兒8例，CLP患兒11例；綜合征型唇腭裂患兒4例，包含了唇腭裂畸形合并先天性心臟病患兒3例，Van der Woude’s綜合癥患兒1例。 2、所有病例均事先經(jīng)常規(guī)G顯帶染色體核型分析，只有染色體核型正常者才進(jìn)一步行CMA分析。 3、分別使用Qiagen DNA提取試劑盒從患者外周血中提取基因組DNA，并使用NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)DNA的濃度和純度進(jìn)行測(cè)量。 4、根據(jù)美國(guó)Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平臺(tái)（195萬(wàn)拷貝數(shù)探針和75萬(wàn)SNP探針）的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程對(duì)樣本DNA進(jìn)行處理。 5、使用相配套的CHAS軟件對(duì)掃描芯片產(chǎn)生的.CEL文件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 6、根據(jù)DGV（含正常人的CNVs）、DECIPHER（含患者的表型及致病性片段）、OMIM（含已知的致病基因）、CAGdb、ISCA（含良性與致病性的CNVs）、UCSCGenome Browser（顯示片段中基因的內(nèi)容及功能）及PUBMED等以及本實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)，判斷CNVs的性質(zhì)。 7、針對(duì)臨床意義不明確的CNVs結(jié)果，進(jìn)一步行父母樣本檢測(cè)進(jìn)行綜合家系分析，明確CNVs的性質(zhì)。 8、使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）對(duì)致病性CNVs進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 1、全部33例患兒均成功進(jìn)行了全基因組高分辨率CMA技術(shù)檢測(cè)，CMA結(jié)果提示6例患兒含有致病性CNVs，致病性CNVs檢出率為18.2%(6/33)；26例患兒含有良性CNVs，良性CVNs檢出率為78.8%（26/33）；1例患兒含有臨床意義不明確的CNVs（VOUS），VOUS檢出率為3.0%（1/33）。 2、CMA結(jié)果提示6例含致病性CNVs的患兒中，4例（13.8%，4/29）來(lái)源于非綜合癥型唇腭裂患兒，包含了3例單純性CP患兒（37.5%，3/8），1例CLP患兒（9.1%，1/11）；致病性CNVs分別為10q22.2-q22.3微缺失（1766kb）、20p12.1微缺失（184kb）、22q11.21-q11.23微缺失（3163kb）、8p23.1微重復(fù)（198kb）；此外，10q22.2-q22.3區(qū)域中的MYST4基因，20p12.1區(qū)域中的MACROD2基因是新發(fā)現(xiàn)的先天性唇腭裂可疑致病基因。2例（50%，2/4）來(lái)源于綜合癥型唇腭裂患兒，致病性CNVs分別為18q12.3微重復(fù)（638kb）、6q26微缺失（389kb）。 3、CMA結(jié)果提示26例含良性CNVs的患兒中，，19例患兒的CNVs存在于DGV數(shù)據(jù)庫(kù)/CHOP數(shù)據(jù)庫(kù)中，最常見(jiàn)的4種（P≥5%）分別為8p11.2微缺失/微重復(fù)（11.9%）、14q32.33微重復(fù)（18.1%）、14q11.2微缺失（5.8%）、22q11.22微重復(fù)（11.9%）；4例患兒的CNVs來(lái)源于正常父母一方，分別為9q31.1微重復(fù)、10p12.33微缺失、7q31.1微缺失、Xp22.33微重復(fù)，為國(guó)際上首次報(bào)道。 4、CMA結(jié)果提示1例患兒含有臨床意義仍然不明確CNVs，該VOUS為5q21.1微缺失（110kb）。 結(jié)論 1、全基因組高分辨率CMA技術(shù)在先天性唇腭裂畸形而染色體核型正常的患兒中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，該技術(shù)能夠?qū)⒅虏⌒訡NVs的總體檢出率額外提高18.2%，并且具有識(shí)別新的致病基因的能力。 2、CMA技術(shù)對(duì)唇腭裂畸形合并其他結(jié)構(gòu)異常的綜合征型患兒其致病性CNVs檢出率高于單一唇腭裂畸形的非綜合征型唇腭裂患兒（50%vs13.8%）。 3、在非綜合征性唇腭裂患兒中，致病性CNVs檢出率從高到低排列為單純性CP(37.5%)CLP(9.1%)單純性CL（0）。單純性CL患兒其基因組發(fā)生不平衡變異的風(fēng)險(xiǎn)較低。 4、在臨床遺傳學(xué)診斷和產(chǎn)前診斷中，對(duì)于常規(guī)染色體核型分析未見(jiàn)異常的單純性CP、CLP、以及先天性唇腭裂畸形合并其他結(jié)構(gòu)異常的臨床病例，建議進(jìn)一步行全基因組高分辨率CMA技術(shù)分析。 5、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)分析人員和臨床遺傳咨詢(xún)醫(yī)生之間的充分交流、結(jié)合家系綜合分析以及內(nèi)外部數(shù)據(jù)庫(kù)之間的數(shù)據(jù)比對(duì)都能夠顯著降低臨床意義不明確的CNVs(VOUS)。
[Abstract]:objective
1, to explore the application value of chromosome microarrayanalysis (CMA) in patients with congenital cleft lip and palate.
2, to explore the difference in the prevalence of CMA in isolated cleft lip (CL), pure cleft palate (isolated cleftpalate, CP) and cleft lip and palate (cleft lip with palate).
3, to provide theoretical basis for establishing genetic diagnosis and prenatal diagnosis of congenital cleft lip and palate.
4, we provide laboratory support for exploring the strategy of using CMA technology to explain the puzzled strategies of CNVs (variants of unknown significance, VOUS) in the genetic diagnosis and consultation of congenital cleft lip and palate deformity.
Method
1, selected from August 2012 to August 2013 in the Department of Stomatology, Guangzhou women and children's Medical Center, all kinds of congenital cleft lip and palate deformity treated by surgical correction, 33 cases of children with or without other malformed clinical children: 29 cases of children with non syndrome cleft lip and palate, including 10 children with simple CL. 8 children with simple CP, 11 children with CLP, 4 children with cleft lip and palate, 3 cases of cleft lip and palate with congenital heart disease, and 1 children with Van der Woude 's syndrome.
2, all cases were analyzed regularly by G chromosome karyotype. Only CMA with normal karyotype was further analyzed.
3, genomic DNA was extracted from peripheral blood of patients by Qiagen DNA extraction kit, and the concentration and purity of DNA were measured by NanoDrop spectrophotometer.
4, the sample DNA is processed according to the standard experimental operation procedure of CytoScan HD chip platform (1 million 950 thousand copy number probe and 750 thousand SNP probe) of Affymetrix company.
5, use the matching CHAS software to analyze the.CEL files produced by the scanning chip.
6, according to DGV (including normal CNVs), DECIPHER (including the patient's phenotypic and pathogenetic fragments), OMIM (including known pathogenic genes), CAGdb, ISCA (benign and pathogenicity CNVs), UCSCGenome Browser (the contents and functions of the gene in the display segment) and PUBMED and so on, and the internal database of our laboratory to compare the analysis results online, judge the results. The nature of CNVs.
7, in view of the unclear clinical results of CNVs, parents were further tested for comprehensive family analysis to clarify the nature of CNVs.
8, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to verify the pathogenicity CNVs of PCR.
Result
1, all 33 cases had successful complete genome high resolution CMA test. CMA results showed that 6 cases had pathogenicity CNVs, pathogenetic CNVs detection rate was 18.2% (6/33), 26 cases with benign CNVs, benign CVNs detection rate of 78.8% (26/33), 1 children with clinically significant CNVs (VOUS), VOUS detection rate 3% (1 /33).
2, CMA results suggested that of the 6 children with pathogenic CNVs, 4 (13.8%, 4/29) were derived from children with non syndromic cleft lip and palate, including 3 children with simple CP (37.5%, 3/8), 1 cases of CLP (9.1%, 1/11); pathogenic CNVs were 10q22.2-q22.3 microdeletion (1766kb), 20p12.1 microdeletion (184kb), microsatellite microdeletion. (198kb); in addition, the MYST4 gene in the 10q22.2-q22.3 region and the MACROD2 gene in the 20p12.1 region are the newly discovered congenital lip and palate cleft suspected pathogenic gene.2 (50%, 2/4) from children with syndrome type lip and palate. The pathogenic CNVs is 18q12.3 microrepetition (638kb), 6q26 microdeletion (389kb).
3, CMA results showed that of the 26 children with benign CNVs, 19 cases were found in the DGV database /CHOP database, and the most common 4 species (P > 5%) were 8p11.2 microdeletion / micro repetition (11.9%), 14q32.33 microrepetition (18.1%), 14q11.2 microdeletion (5.8%), 22q11.22 microrepetition (11.9%), 4 cases of CNVs from the normal parents, respectively. It is the first report in the world for 9q31.1 duplication, 10p12.33 microdeletions, 7q31.1 microdeletions and Xp22.33 microduplication.
4, CMA results indicate that the clinical significance of 1 cases is still unclear, CNVs, and the VOUS is 5q21.1 microdeletion (110kb).
conclusion
1, the whole genome high resolution CMA technique is of great value in children with congenital cleft lip and palate with normal karyotype. This technique can increase the total physical examination rate of pathogenicity CNVs by an additional 18.2% and have the ability to identify new pathogenic genes.
2, the incidence of pathogenic CNVs in children with cleft lip and palate with other structural abnormalities is higher than that of non syndromic cleft lip and palate children with single cleft palate and cleft palate (50%vs13.8%).
3, in children with non syndromic cleft lip and palate, the incidence of pathogenicity CNVs was from high to low to simple CP (37.5%) CLP (9.1%) simple CL (0). The risk of unbalanced genomes in children with simple CL was low.
4. In clinical genetic diagnosis and prenatal diagnosis, there is no abnormal simple CP, CLP, and congenital cleft lip and Palate Malformation with other structural abnormalities in clinical genetics diagnosis and prenatal diagnosis. It is suggested that the whole genome high resolution CMA technique should be further analyzed.
5, full communication between laboratory data analysts and clinical genetic counselling doctors, combined with family analysis and data comparisons between internal and external databases, can significantly reduce the CNVs (VOUS) that is not clear in clinical significance.
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R782.2

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本文編號(hào)：1977498