本文選題：牙周組織工程 + 種子細(xì)胞�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的牙周組織缺損或喪失常見于牙周病和牙周創(chuàng)傷。牙周組織缺損最理想的愈合是達到牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的完全功能性再生,從而獲得牙周新附著。目前在臨床上,采用牙周翻瓣術(shù)、植骨手術(shù)以及引導(dǎo)組織再生等技術(shù)可以通過不同的方式終止病變的發(fā)展,使病變組織得到一定的恢復(fù)。但要達到牙周組織的完全再生,尤其是牙周新附著的建立,目前尚未解決。如何利用再生性治療方法獲得牙周新附著,重建天然牙周組織的解剖結(jié)構(gòu)和支持功能,是國內(nèi)外學(xué)者所追求的目標(biāo)和著力研究的熱點課題。組織工程理論的提出和技術(shù)的發(fā)展,為牙周組織再生領(lǐng)域提供了新的思路和方法。牙周組織工程技術(shù)的核心是構(gòu)建種子細(xì)胞與支架材料的三維空間復(fù)合體。以往的研究表明,作為牙周組織再生基礎(chǔ)的牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells,PDLCs)來源非常有限,且大多數(shù)研究都集中于把組織工程其他領(lǐng)域的支架材料直接或通過簡單的表面修飾用于牙周組織工程,以致牙周組織很難達到有效的組織再生和功能重建。因此,種子細(xì)胞的來源、適宜支架材料的選擇、種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合體的構(gòu)建成為牙周組織工程技術(shù)亟待解決的難題。本實驗運用組織工程學(xué)方法,以Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞(gingival fibroblasts,GFs)作為種子細(xì)胞,與Bio-Gide膠原膜和小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)支架材料復(fù)合培養(yǎng),體外構(gòu)建組織工程化牙周復(fù)合體,體內(nèi)重建牙周組織修復(fù)犬牙周組織缺損,組織學(xué)觀察牙周組織再生和新附著建立情況。初步探討構(gòu)建組織工程化牙周復(fù)合體及其用于牙周組織再生的可行性,為進一步利用組織工程原理實現(xiàn)牙周組織再生性治療的臨床研究提供實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。方法:1牙周復(fù)合體支架材料的選擇及降解實驗1.1小腸黏膜下層支架材料的制備取自封閉飼養(yǎng)的成年豬空腸50 cm,按Abraham方法制備。1.2 Bio-Gide膠原膜支架材料1.3 Bio-Gide膠原膜和小腸黏膜下層支架材料降解實驗分別在大鼠兩側(cè)皮下各平鋪放置Bio-Gide膠原膜和小腸黏膜下層支架材料各一塊,嚴(yán)密縫合皮膚并染色標(biāo)記植入位置。1.4標(biāo)本HE染色觀察支架材料降解情況2牙齦成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及礦化誘導(dǎo)2.1 Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定采用組織塊法進行Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。細(xì)胞免疫組化波形蛋白(vimentin)染色及掃描電鏡觀察鑒定牙齦成纖維細(xì)胞。2.2 Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞的礦化誘導(dǎo)及鑒定取原代培養(yǎng)Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞第2~3代對數(shù)生長期細(xì)胞,更換完全培養(yǎng)液為礦化誘導(dǎo)液。每隔48小時換液一次。誘導(dǎo)培養(yǎng)第11天,倒置顯微鏡下觀察形成礦化結(jié)節(jié)。2%茜素紅染色、1%硝酸銀染色鑒定礦化結(jié)節(jié)。3組織工程化牙周復(fù)合體的構(gòu)建3.1組織工程化牙周膜的構(gòu)建將制備好的Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞,以2×106個/ml細(xì)胞濃度雙面接種于Bio-Gide膠原膜支架材料上,生長7天。3.2組織工程化礦化膜的構(gòu)建將制備好的Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞,以2×106個/ml細(xì)胞濃度單面接種于小腸黏膜下層支架材料上。完全培養(yǎng)液靜置培養(yǎng),3天后,換以礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)8天。3.3組織工程化牙周復(fù)合體(組織工程化的礦化膜+牙周膜+礦化膜)的“三明治”結(jié)構(gòu)的構(gòu)建由組織工程化的礦化膜+牙周膜+礦化膜構(gòu)建“三明治”結(jié)構(gòu)的組織工程化牙周復(fù)合體。4組織工程化牙周復(fù)合體重建的動物實驗4.1牙周組織缺損動物模型的建立及分組正常對照組:沒有任何創(chuàng)傷,保留正常的牙周結(jié)構(gòu)。牙周創(chuàng)傷組:建立牙周組織缺損后,不做任何治療處理,齦瓣復(fù)位,嚴(yán)密縫合。組織工程化牙周膜組:建立牙周組織缺損,將組織工程化牙周膜植入牙周組織缺損內(nèi),齦瓣復(fù)位,嚴(yán)密縫合。組織工程化牙周復(fù)合體組:建立牙周組織缺損,將“三明治”結(jié)構(gòu)的組織工程化牙周復(fù)合體,植入牙周組織缺損內(nèi),齦瓣復(fù)位,嚴(yán)密縫合。4.2組織工程化牙周復(fù)合體修復(fù)牙周組織缺損的實驗觀察分別于術(shù)后10、20、30天時間點各處死3只動物,取上下頜骨,按分組分段切取實驗牙及牙槽骨,標(biāo)本固定于10%福爾馬林中,脫鈣,HE染色。結(jié)果:1牙周復(fù)合體支架材料的選擇及降解實驗1.1支架材料植入術(shù)后動物大體觀察所有大鼠均健康成活,無傷口紅腫等炎性反應(yīng),切口均一期愈合,至處死時均無感染、無移植物排出,進食和活動正常。各時間點支架材料植入局部組織均未見壞死等異常表現(xiàn),材料未見包裹形成。1.2組織學(xué)觀察1.2.1支架材料植入術(shù)后2周Bio-Gide膠原膜支架材料植入后2周,可見Bio-Gide膠原纖維斷裂,少量成纖維細(xì)胞長入膠原纖維間隙,另有少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤。小腸黏膜下層支架材料植入后2周,小腸黏膜下層結(jié)構(gòu)仍清晰可辨,可見成纖維細(xì)胞長入及大量新生毛細(xì)血管,局部有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤。1.2.2支架材料植入術(shù)后4周Bio-Gide膠原膜支架材料植入后4周,可見Bio-Gide膠原纖維腫脹、斷裂,成纖維細(xì)胞長入膠原纖維間隙。小腸黏膜下層支架材料植入后4周,小腸黏膜下層可見降解明顯,己出現(xiàn)纖維結(jié)構(gòu)松散、斷裂,淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎細(xì)胞減少。1.2.3支架材料植入術(shù)后6周Bio-Gide膠原膜支架材料植入后6周,可見Bio-Gide膠原纖維腫脹、斷裂明顯,大量成纖維細(xì)胞長入。小腸黏膜下層支架材料植入后6周,小腸黏膜下層繼續(xù)降解,但仍可見少量支架結(jié)構(gòu),局部少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤,大量成纖維細(xì)胞長入。1.2.4支架材料植入術(shù)后8周Bio-Gide膠原膜支架材料植入后8周,可見Bio-Gide膠原纖維斷裂、消失,大量成纖維細(xì)胞長入。小腸黏膜下層支架材料植入后8周,小腸黏膜下層大部分降解,局部少量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤,大量成纖維細(xì)胞長入。1.2.5支架材料植入術(shù)后10周Bio-Gide膠原膜支架材料植入后10周,Bio-Gide膠原膜支架材料結(jié)構(gòu)消失,完全降解,而被脂肪、纖維等結(jié)締組織取代。小腸黏膜下層支架材料植入后10周,小腸黏膜下層支架材料基本完全降解,大量成纖維細(xì)胞長入。1.2.6支架材料植入術(shù)后12周小腸黏膜下層支架材料植入后12周,小腸黏膜下層支架材料完全降解,被大量成纖維細(xì)胞、脂肪組織、新生毛細(xì)胞血管及膠原所取代。2牙齦成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及礦化誘導(dǎo)2.1 Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天,可見梭形細(xì)胞向組織塊周圍爬出,大多數(shù)為長梭形,胞體豐滿,胞漿均勻,胞核大呈圓形或橢圓形位于中央,胞質(zhì)向外伸出2~3個長短不等的突起,小部分細(xì)胞呈扁平多邊形。繼續(xù)培養(yǎng)6~7天后,倒置顯微鏡下可見Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀、漩渦狀生長。第2代Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞對抗波形蛋白(vimentin)染色陽性,胞漿呈棕黃色著色,陽性顆粒分布均勻,細(xì)胞核染為藍色。掃描電鏡觀察,可見Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞體積較大,輪廓清楚,多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu),其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形,核仁大而清晰。2.2 Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞體外礦化誘導(dǎo)及鑒定Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)礦化第11天,倒置顯微鏡下,可見大小不等的礦化結(jié)節(jié)形成,色深近黑色,呈圓形或橢圓形。茜素紅染色結(jié)果顯示,Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞體外礦化誘導(dǎo)第11天,可見大小不等的橘紅色鈣化結(jié)節(jié),為茜素紅與鈣鹽形成的復(fù)合物。1%硝酸銀染色結(jié)果顯示,Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞體外礦化誘導(dǎo)第11天,可見大小不等的黑色及黑褐色鈣結(jié)節(jié)形成,說明有大量鈣鹽沉積,即礦化結(jié)節(jié)形成。3組織工程化牙周復(fù)合體的構(gòu)建3.1組織工程化牙周膜的構(gòu)建將Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞雙面接種于Bio-Gide膠原膜支架材料上,構(gòu)建組織工程化牙周膜。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,Bio-Gide膠原膜支架材料具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),牙齦成纖維細(xì)胞在其上貼附牢固,生長旺盛,伸展充分。牙齦成纖維細(xì)胞與Bio-Gide膠原膜支架材料形成的復(fù)合物為纖維網(wǎng)狀組織,具備牙周膜的纖維狀結(jié)構(gòu)。3.2組織工程化礦化膜的構(gòu)建將Beagle犬牙齦成纖維細(xì)胞單面接種于小腸黏膜下層支架材料上。礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)8天,倒置顯微鏡下觀察,可見礦化結(jié)節(jié)形成。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,小腸黏膜下層具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),牙齦成纖維細(xì)胞在其上貼附牢固,生長旺盛,可見礦化結(jié)節(jié)形成,體外成功構(gòu)建組織工程化礦化膜。3.3組織工程化牙周復(fù)合體的構(gòu)建組織工程化的礦化膜+牙周膜+礦化膜的“三明治”結(jié)構(gòu)的組織工程化牙周復(fù)合體,形成類似牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)的正常結(jié)構(gòu),外觀呈海綿狀,具有一定的機械性能和可塑性。4組織工程化牙周復(fù)合體重建的動物實驗研究4.1牙周組織缺損動物模型的建立術(shù)前Beagle犬的牙周狀況良好,牙齦無紅腫,未探及牙周袋,翻瓣術(shù)中也未見牙槽骨缺損。實驗共分四組,采用自身對照,每只Beagle犬的雙側(cè)上下頜四個象限第2、3、4前磨牙為實驗牙,從左上頜、右上頜、再到左下頜、右下頜,分別為正常對照組、牙周創(chuàng)傷組、組織工程化牙周膜組和組織工程化牙周復(fù)合體組。采用外科手術(shù)方法造成Beagle犬牙周組織的急性損傷,使每顆實驗牙近中根的近中側(cè)和遠中側(cè)形成2 mm的牙周組織缺損,缺損從牙頸部直達根尖1/3,根面用齦下刮治器去除牙周膜及表面牙骨質(zhì)。4.2組織工程化材料植入術(shù)后動物大體觀察所有Beagle犬術(shù)后均健康存活到實驗結(jié)束,活動及飲食正常,手術(shù)切口一期愈合,未見感染及并發(fā)癥。組織工程化材料植入牙周組織缺損后,未見材料溢出,植入局部和全身均未見明顯不良反應(yīng)。4.3組織學(xué)觀察4.3.1組織工程化材料植入術(shù)后第10天正常對照組:Beagle犬前磨牙根分叉區(qū)可見牙骨質(zhì)、牙周膜、固有牙槽骨、松質(zhì)骨。其中,松質(zhì)骨由骨小梁和骨髓組成,骨小梁粗大致密,大小不均的骨髓間隙散在分布,間隙內(nèi)可見脂肪細(xì)胞。牙周創(chuàng)傷組:術(shù)后10天,牙骨質(zhì)未新生,牙周膜未修復(fù),有少量新生牙槽骨。組織工程化牙周膜組:術(shù)后10天,未見牙周膜形成。組織工程化牙周復(fù)合體組:術(shù)后10天,可見新形成的牙周膜纖維,大量新生骨開始形成骨小梁,牙骨質(zhì)開始重建。4.3.2組織工程化材料植入術(shù)后第20天正常對照組:Beagle犬前磨牙根分叉區(qū)可見牙骨質(zhì)、牙周膜、固有牙槽骨、松質(zhì)骨。其中,松質(zhì)骨由骨小梁和骨髓組成,骨小梁粗大致密,大小不均的骨髓間隙散在分布,間隙內(nèi)可見脂肪細(xì)胞。牙周創(chuàng)傷組:術(shù)后20天,牙骨質(zhì)未新生,牙周膜未修復(fù),有少量新生牙槽骨形成。組織工程化牙周膜組:術(shù)后20天,牙骨質(zhì)處于重建中,可見新生的牙槽骨和牙周膜纖維。組織工程化牙周復(fù)合體組:術(shù)后20天,牙骨質(zhì)修復(fù)完成,牙槽骨重建完成,牙周膜纖維結(jié)構(gòu)清晰。4.3.3組織工程化材料植入術(shù)后第30天正常對照組:Beagle犬前磨牙根分叉區(qū)可見牙骨質(zhì)、牙周膜、固有牙槽骨、松質(zhì)骨。其中,松質(zhì)骨由骨小梁和骨髓組成,骨小梁粗大致密,大小不均的骨髓間隙散在分布,間隙內(nèi)可見脂肪細(xì)胞。牙周創(chuàng)傷組:術(shù)后30天牙骨質(zhì)未新生,牙周膜未修復(fù)。組織工程化牙周膜組:術(shù)后30天,牙骨質(zhì)處于重建中,可見成骨細(xì)胞和新生的牙周膜纖維。組織工程化牙周復(fù)合體組:術(shù)后30天,牙骨質(zhì)修復(fù)完成,牙周膜成熟,穿通纖維清晰,牙周新附著形成。結(jié)論1牙齦成纖維細(xì)胞具有較強的分化能力和礦化誘導(dǎo)的潛力,能夠形成礦化結(jié)節(jié)。為組織工程化礦化膜的構(gòu)建,提供種子細(xì)胞。2牙齦成纖維細(xì)胞接種于Bio-Gide膠原膜支架上,成功構(gòu)建組織工程化牙周膜。3牙齦成纖維細(xì)胞接種于豬小腸黏膜下層支架上,誘導(dǎo)礦化,成功構(gòu)建組織工程化礦化膜。4將雙層組織工程化礦化膜,中間夾上組織工程化牙周膜,成功構(gòu)建“三明治”結(jié)構(gòu)的組織工程化牙周復(fù)合體。5組織工程化牙周膜在動物體內(nèi)能修復(fù)牙周組織缺損,獲得牙周組織再生,但牙槽骨和牙骨質(zhì)的形成緩慢。6組織工程化的礦化膜+牙周膜+礦化膜的“三明治”結(jié)構(gòu)的牙周復(fù)合體在動物體內(nèi)能完全修復(fù)牙周組織缺損,獲得最為理想的牙周組織結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:Objective To study the effects of periodontal tissue regeneration on periodontal tissue regeneration and to establish a new method for the regeneration of periodontal tissues . Tissue - engineered periodontal ligament complex was used to construct periodontal tissue defect . The tissue - engineered periodontal complex was implanted into periodontal tissue defect . The tissue engineering periodontal ligament was implanted into periodontal tissue defect . A tissue engineered periodontal ligament was constructed . The results showed that the tissue engineered periodontal complex had a good porous network structure , and the gingival fibroblasts were well attached to the periodontal ligament . Tissue engineering periodontal ligament group : 20 days after operation , alveolar bone and cancellous bone were observed . Tissue engineered periodontal ligament was successfully constructed by tissue engineering periodontal ligament in the middle clamp . The tissue engineering periodontal ligament could be used to repair the periodontal tissue defect in the animal , and periodontal tissue regeneration was achieved .
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R783.1

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本文編號：1966764