本文選題：牙髓 + Toll樣受體4��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 齲病是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的常見病、多發(fā)病,是導(dǎo)致牙齒缺失的主要原因之一。齲病破壞咀嚼器官完整性,嚴重影響患者的消化功能、美觀、心理健康及全身健康。齲病是在以細菌為主的多種因素影響下,牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的疾病。齲病過程中,細菌及其分泌的物質(zhì)沿牙本質(zhì)小管向牙髓組織入侵,修復(fù)性牙本質(zhì)作為牙髓組織的保護屏障而形成,抵御外界細菌的入侵和刺激。牙髓組織中具有分化潛能的未分化間充質(zhì)細胞為牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)。牙髓干細胞受到外界刺激后分化為成牙本質(zhì)細胞并分泌形成修復(fù)性牙本質(zhì)從而保護牙髓的過程被認為是牙髓組織參與的天然免疫反應(yīng)過程。 天然免疫反應(yīng)是人體抵御病原體入侵和組織損傷的第一道生物屏障。人類的天然免疫反應(yīng)是通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)特異性識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMPs)來實現(xiàn)的。Toll樣受體4(Toll-like receptor4, TLR4)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)家族成員,屬于PRRs的一種,可以與PAMPs特異性結(jié)合,引起人體的天然免疫反應(yīng),抵抗病原體的侵犯,在人類的天然免疫反應(yīng)過程中起重要作用。 細胞的生物學(xué)特性：增殖、遷移和分化是組織修復(fù)的重要因素。目前已有研究報道,TLRs的激動劑可以引起細胞的遷移、侵襲并釋放大量免疫調(diào)節(jié)因子。革蘭氏陰性菌胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激成牙本質(zhì)細胞后可以促進細胞的遷移能力。當牙乳頭細胞中的TLR4被LPS激活后,可以釋放大量的細胞因子如IL-1β, IL-6及IL-8。同樣,纖維細胞受到LPS刺激后IL-1、CCL7、CCL26和CXCL11的分泌量增加。LPS可以抑制牙乳頭干細胞成骨能力。這些報道提示,TLR4可能在牙髓組織的修復(fù)和再生過程中起重要作用。 目前,關(guān)于TLR4在牙髓干細胞天然免疫反應(yīng)中的作用機制并不明確。本課題比較了健康和深齲牙髓組織中TLR4的定位表達。觀察TLR4被激活和抑制表達后對牙髓干細胞增殖、遷移、礦化能力的調(diào)控作用。旨在明確TLR4在牙髓天然免疫反應(yīng)中的作用。 本論文主要包括以下五章內(nèi)容： 第一章TLR4在人健康和深齲牙髓組織中的定位表達 本章實驗主要采用脫礦后HE染色,免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色的方法,比較TLR4在健康和深齲牙髓組織中的定位表達。材料與方法 (一)HE染色 隨機抽取臨床上18-26歲健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、無齲壞的牙齒以及深齲但無牙髓炎癥狀的牙齒各3例(經(jīng)患者本人及家屬知情同意)。拔除前徹底消毒,拔出后即刻放入10%福爾馬林固定液中儲存。EDTA聯(lián)合微波超聲脫礦法在10%EDTA溶液中脫礦4周后進行脫水、透明及包埋處理。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水,經(jīng)蘇木精染色、伊紅染色后脫水、透明、封片,正置顯微鏡下觀察牙齒組織形態(tài)。 (二)牙髓組織免疫化學(xué)染色 取臨床上18-26歲健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、無齲壞的牙齒(8例)以及深齲但無牙髓炎癥狀的牙齒(12例)(經(jīng)患者本人及家屬知情同意)。拔除前徹底消毒,拔出后即刻放入10%福爾馬林固定液中儲存。標本沿釉牙骨質(zhì)界用高速手機環(huán)繞牙頸部磨出2mm深度的溝槽,將牙齒沿溝槽劈開,取出牙髓,放入包埋盒內(nèi),標記后進行脫水、透明、包埋及切片處理。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,3%H2O2滅活過氧化物酶,山羊血清孵育30min, TLR4鼠抗人一抗(1：100)4℃孵育過夜。PBS洗3次,兔抗鼠二抗(1：500)室溫孵育1h, PBS沖洗3次。DAB顯色液染色2min,鏡下觀察,見標本出現(xiàn)棕褐色特異性染色時終止染色。蒸餾水充分沖洗,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片,正置顯微鏡觀察、拍照。 (三)牙髓組織免疫熒光染色 標本同牙髓免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,3%H2O2滅活過氧化物酶,山羊血清孵育30min。TLR4鼠抗人一抗(1：100)4℃孵育過夜,PBS洗3次。FITC標記的兔抗鼠二抗(1：500)室溫避光孵育1h,PBS沖洗3次,防淬滅封片劑封片,正置熒光顯微鏡觀察、拍照。 結(jié)果 (一)HE染色 結(jié)果顯示,深齲牙齒牙本質(zhì)中牙本質(zhì)小管被破壞并存在大量細菌團塊,但牙髓組織與健康牙髓組織相比未見明顯變化。(二)免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色 TLR4主要分布于牙髓組織的成牙本質(zhì)細胞層及血管周圍組織,且深齲牙髓中TLR4陽性染色較正常牙髓組織增多。提示TLR4可能參與了深齲牙髓的天然免疫反應(yīng)。 第二章人牙髓干細胞的體外培養(yǎng)和鑒定 本章實驗主要采用組織塊酶消化法分離培養(yǎng)人牙髓干細胞,并從細胞表面標記物分析、形態(tài)學(xué)觀察、生長曲線及多向分化能力等方面對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定,為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定可靠的細胞來源。 材料與方法 (一)人牙髓干細胞的分離培養(yǎng) 取臨床上18-26歲健康人因正畸或阻生而拔除的健康、完整、無齲壞的牙齒30例(經(jīng)患者本人及家屬知情同意)。拔除前徹底消毒,拔出后沿釉牙骨質(zhì)界用高速手機環(huán)繞牙頸部磨出2mm深度的溝槽,即刻放入預(yù)冷的含有1%雙抗的不完全培養(yǎng)基中儲存。在超凈臺內(nèi)將牙齒從培養(yǎng)基中取出,用含雙抗的PBS沖洗3遍,將牙齒沿溝槽劈開,取出牙髓,去除根尖2mm的牙髓,置于PBS緩沖液內(nèi)反復(fù)漂洗至少3次。用眼科剪將牙髓組織剪成約0.5mm3大小的小塊,用Ⅰ型膠原酶(3mg/mL)37℃消化組織塊10min,加入完全培養(yǎng)基終止消化,1000r/min離心3min,棄上清,加入少量完全培養(yǎng)基,混勻后將懸濁液接種至6孔板內(nèi),將蓋玻片壓于組織之上,補充適量液體。放入C02孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng),一天后換液,以后每3d換液,倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待細胞游出并達到70%-80%匯合時以0.25%胰酶消化,按1：2傳代。3-5代細胞用于后續(xù)實驗。 (二)流式細胞術(shù)檢測牙髓干細胞表面標記物 取第3代處于對數(shù)生長期的牙髓干細胞,調(diào)整細胞密度至1×105-5×105/mL。用CD29、CD34、CD45、CD90、CD44、CD106抗體冰上避光敷育細胞1h,PBS漂洗2遍,加入1mL固定液。吹勻細胞后流式細胞儀檢測細胞表面標記物。 (三)多向分化能力檢測 取處于對數(shù)生長期的第3代牙髓干細胞,以2×105/孔細胞接種于六孔板中,待細胞生長達到80%融合時,更換成骨、成軟骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液,將牙髓干細胞向成骨、成軟骨及脂肪方向誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,分別用茜素紅、阿新藍、油紅O染色,倒置顯微鏡下觀察并拍照。 (四)細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線 取處于對數(shù)生長期的第3代細胞,以1×104/孔L的密度接種于24孔板。分別于培養(yǎng)的1d、3d、5d、7d用細胞計數(shù)儀進行活細胞計數(shù),每組3個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次,求均值。記錄每次細胞數(shù)量,繪制牙髓干細胞的生長曲線。(五)MTT法繪制細胞生長曲線 取處于對數(shù)生長期的第3代細胞,以3×103/孔的密度接種于96孔板,分別于培養(yǎng)的Id、3d、5d、7d進行MTT檢測。檢測時每孔加入MTT液20μL,37℃繼續(xù)孵育4h,用細針頭輕輕吸去培養(yǎng)液。每孔加入150μL DMSO,微振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值,求均值。實驗重復(fù)3次。繪制牙髓干細胞的生長曲線。(六)統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以x±s表示。 結(jié)果 (一)牙髓干細胞的原代培養(yǎng) 組織塊經(jīng)酶消化后變的疏松并可發(fā)現(xiàn)部分游離的單個細胞,接種后3-5d便有細胞自組織塊游出,7-10d可以傳代。細胞呈梭形,胞質(zhì)透光性好。 (二)細胞表面標記物分析 流式細胞儀檢測牙髓干細胞表面標記物。結(jié)果顯示,細胞表達間充質(zhì)干細胞表面標記物CD29、CD44、CD90呈陽性,表達率分別為99.26%、95.17%和99.68%；表達造血干細胞表面標記物CD34、CD45、CD106呈陰性,表達率分別為0.1%、0.33%和0.32%。說明培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)來源。 (三)細胞多向分化能力 細胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,細胞數(shù)量迅速增加,呈復(fù)層生長,細胞極性發(fā)生變化,部分區(qū)域細胞聚集成團。茜素紅染色可見大小不等的紅褐色礦化結(jié)節(jié)分散分布于培養(yǎng)皿中。經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,有半透明狀細胞團形成,阿新藍染色后可見藍染區(qū)。經(jīng)成脂誘導(dǎo)21d后,脂滴逐漸融合變大,油紅O染色后可見橘紅色脂滴分布于細胞質(zhì)中。 (四)生長曲線 細胞計數(shù)法及MTT法繪制牙髓干細胞生長曲線。兩種方法繪制的生長曲線均成“S”形。細胞于接種后3d進入對數(shù)生長期,5d后進入平臺期。細胞生長狀態(tài)良好。 第三章脂多糖與變形鏈球菌刺激下TLR4在牙髓干細胞中的表達 本章實驗采用LPS及變形鏈球菌提取物對牙髓干細胞進行刺激,模擬深齲狀態(tài)下牙髓的內(nèi)環(huán)境。用RT-PCR技術(shù)、western blot和細胞免疫熒光檢測TLR4表達變化。探討LPS及變形鏈球菌提取物是否可以改變牙髓干細胞TLR4的表達。 材料與方法 (一)變形鏈球菌提取物的制備 收集變形鏈球菌標準株UA159于離心管中,PBS洗菌2次。利用超聲破碎儀破碎細菌,離心收集上清液。0.22μm濾器過濾上清液,蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度,用DMEM稀釋細菌提取液至1mg/mL的儲存濃度,分裝后存放于-80℃保存?zhèn)溆谩?(二) RT-PCR 1μg/mL LPS或1μg/mL變形鏈球菌提取物刺激牙髓干細胞后0h、12h、24h、48h收集細胞。Trizol抽提牙髓干細胞的總RNA,分光光度計檢測RNA濃度,PrimeScriptR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用SYBR法進行PCR擴增,所有基因通過7500RT-PCR儀進行檢測后,用相對定量法計算2-△△CT值代表TLR4的相對表達強度。實驗重復(fù)3次。 (三)Western blot 1μg/mL LPS或1μg/mL變形鏈球菌提取物刺激牙髓干細胞24h。蛋白裂解液抽提細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫雜交、顯色。(四)細胞免疫熒光 取處于對數(shù)生長期的3-5代牙髓干細胞,以3×103個細胞接種于玻片上。1μg/mL LPS或1μg/mL變形鏈球菌提取物刺激牙髓干細胞24h。4%的甲醛室溫固定20min,0.2%Triton X-100透化,10%山羊血清封閉劑孵育10min, TLR4鼠抗人一抗(1：100)4℃C孵育過夜。PBS洗3次,FITC標記的兔抗鼠二抗(1：500)室溫避光孵育1h, DAPI細胞核染色。防淬滅封片劑封片,正置熒光顯微鏡下觀察、拍照。 (五)統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以x±s表示。RT-PCR檢測LPS及變形鏈球菌提取物刺激后牙髓干細胞中TLR4mRNA的表達時采用單因素方差分析進行顯著性分析,然后用Levene's test檢驗方差齊性(檢驗水準α=0.05),如果方差齊則進一步對樣本均數(shù)進行兩兩比較的Bonferroni檢驗,反之,方差不齊則采用近似F檢驗的Welch方法進行分析后Dunnett'T3檢驗進行兩兩比較,檢驗水準a=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 (一)RT-PCR結(jié)果 結(jié)果顯示,與0h牙髓干細胞TLR4表達量相比,在LPS或變形鏈球菌提取物刺激后12h、24h、48h牙髓干細胞中TLR4mRNA的表達均有所增高。LPS刺激實驗中,經(jīng)過單因素方差統(tǒng)計分析,組間TLR4mRNA的表達量具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=852.193,P=0.000)。變形鏈球菌提取物刺激實驗中,經(jīng)過單因素方差統(tǒng)計分析,組間TLR4mRNA的表達量具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1471.990,P=0.000),具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。 (二)Western blot結(jié)果 結(jié)果顯示,LPS及變形鏈球菌提取物刺激組細胞的蛋白條帶灰度明顯高于空白對照組,說明牙髓干細胞受到以上兩種刺激后TLR4蛋白表達增加。 (三)細胞免疫熒光 空白對照組牙髓干細胞中綠色熒光較弱,經(jīng)LPS或變形鏈球菌刺激后牙髓干細胞中綠色熒光明顯增強。 第四章脂多糖與變形鏈球菌激活TLR4后牙髓干細胞生物學(xué)特性的改變 本章實驗討論了LPS及變形鏈球菌提取物激活牙髓干細胞TLR4后對細胞增殖、遷移和礦化等細胞生物學(xué)特性的影響。實驗運用MTT法、劃痕試驗、transwell實驗、茜素紅染色和RT-PCR技術(shù)檢測了牙髓干細胞的增殖、遷移和礦化能力。 材料與方法(一)MTT法繪制細胞生長曲線 取處于對數(shù)生長期的第3-5代細胞,以3x103/孔的密度接種于96孔板。待細胞完全貼壁后,更換含有0.lμg/mL、1μg/mL、10μg/mL LPS或含有0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL變形鏈球菌提取物的完全培養(yǎng)基,空白對照組用普通完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。分別于培養(yǎng)的1d、3d、5d、7d進行MTT檢測。檢測時每孔加入MTT液20μL,37℃繼續(xù)孵育4h,用細針頭輕輕吸去上清培養(yǎng)液。每孔加入150μg DMSO,微振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值,求均值。實驗重復(fù)3次。繪制牙髓干細胞的生長曲線。 (二)劃痕試驗 取處于對數(shù)生長期的第3-5代牙髓干細胞,以1×105/孔的密度接種于6孔板,每組3個復(fù)孔。待細胞生長至90%匯合后,用小槍頭沿尺子在六孔板底劃1mm寬的劃痕,并用倒置顯微鏡檢測各觀測點劃痕寬度一致。更換含有1μg/mL LPS或1μg/mL變形鏈球菌提取物的無血清培養(yǎng)基,在刺激后0h,24h,48h對觀測點進行拍照,觀察細胞水平向遷移能力。 (三)Transwell實驗 取處于對數(shù)生長期的第3-5代牙髓干細胞,以2×104／孔的密度接種于transwell上室,調(diào)整液體至200μL,下室內(nèi)加入500μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)液和1μg/mL LPS或1μg/mL變形鏈球菌提取物；細胞培養(yǎng)箱內(nèi)遷移24h；棄transwell上、下室內(nèi)液體,甲醇固定10min；1%結(jié)晶紫染色15min；棉簽輕輕擦去transwell上室內(nèi)側(cè)未遷移的細胞；顯微鏡下隨機選取5個200倍視野,讀取細胞個數(shù),并計算平均數(shù)；實驗重復(fù)六次并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 (四)礦化結(jié)節(jié)染色 取處于對數(shù)生長期的第3代牙髓干細胞,以2×105個細胞接種于六孔板中,待細胞生長達到80%融合時,更換含有1μg/mL LPS或1μg/mL變形鏈球菌提取物的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液,對照組用普通成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng),將牙髓干細胞向成骨方向誘導(dǎo)分化。培養(yǎng)21d后,分別用茜素紅染色,倒置顯微鏡下觀察并拍照。 (五)RT-PCR 成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,RT-PCR檢測礦化相關(guān)基因OCN、BSP、ALP的表達情況。Trizol抽提牙髓干細胞的總RNA,分光光度計檢測RNA濃度,PrimeScriptR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用SYBR法進行PCR擴增,所有基因通過7500RT-PCR儀進行檢測后,用相對定量法計算2-△△CT值代表基因的相對表達強度。實驗重復(fù)3次。 (六)統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以x±s表示。MTT實驗采用析因設(shè)計的方差分析進行統(tǒng)計分析,組間進一步采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),然后用Levene's test檢驗方差齊性(檢驗水準a=0.05),如果方差齊則進一步對樣本均數(shù)進行兩兩比較的Bonferroni檢驗,反之,方差不齊則采用近似F檢驗的Welch方法進行分析后Dunnett'T3檢驗進行兩兩比較；transwell實驗、礦化結(jié)節(jié)量化比較和RT-PCR檢測礦化相關(guān)基因采用單因素方差分析進行顯著性分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Levene's test檢驗方差齊性(檢驗水準α=0.05),如果方差齊則進一步對樣本均數(shù)進行兩兩比較的Bonferroni檢驗,反之,方差不齊則采用近似F檢驗的Welch方法進行分析后Dunnett'T3檢驗進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 (一)牙髓干細胞增殖能力 MTT法檢測牙髓干細胞增殖能力,各時間點不同濃度LPS組與對照組相比均有較低的OD值,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在各時間點,與對照組相比,各濃度變形鏈球菌提取物組牙髓干細胞增殖能力降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)(二)牙髓干細胞遷移能力劃痕試驗顯示,各濃度LPS和變形鏈球菌提取物可以促進細胞水平向遷移能力,transwell實驗結(jié)果顯示各濃度LPS可以顯著增加細胞垂直向遷移數(shù)量(F=117.722,P=0.000)。變形鏈球菌提取物也可以促進牙髓干細胞移能力(F=142.676,P=0.000)。 (三)牙髓干細胞礦化能力 與對照組相比,LPS和變形鏈球菌提取物可以使牙髓干細胞礦化結(jié)節(jié)形成量減少(F=3369.577,P=0.000),礦化相關(guān)基因OCN (F=74.446, P=0.000), BSP (F=,417.217, P=0.000), ALP (F=60.861,P=0.000)表達量下調(diào)。 第五章TLR4對牙髓干細胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用 本章實驗主要討論TLR4對牙髓干細胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用。實驗構(gòu)建了抑制TLR4表達的慢病毒載體以抑制TLR4的表達,運用MTT法、transwell實驗、茜素紅染色和RT-PCR技術(shù)檢測了牙髓干細胞的增殖、遷移和礦化能力。 材料與方法 (一)抑制TLR4慢病毒表達載體的構(gòu)建及細胞感染 Si-TLR4'慢病毒表達載體為pGLV3/Hl/GFP+Puro,包裝系統(tǒng)為pGag/Pol、 pRev、pVSV-G,包裝細胞：293T細胞。含目的序列的穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,收集濃縮病毒,測定病毒滴度。將慢病毒懸液按照不同感染復(fù)數(shù)感染正常人牙髓干細胞,確定感染參數(shù)。 (二)MTT法繪制細胞生長曲線 牙髓干細胞轉(zhuǎn)染抑制TLR4慢病毒表達載體及空載組慢病毒后,以3×103/孔的密度接種于96孔板。待細胞完全貼壁后,分別于培養(yǎng)的1d、3d、5d、7d進行MTT檢測。檢測時每孔加入MTT液20μL,37℃繼續(xù)孵育4h,用細針頭輕輕吸去上清培養(yǎng)液。每孔加入150μ L DMSO,微振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值,求均值。實驗重復(fù)3次。繪制牙髓干細胞的生長曲線。 (三)Transwell實驗 牙髓干細胞轉(zhuǎn)染抑制TLR4慢病毒表達載體及空載組慢病毒后,以2×104/孔的密度接種于transwell上室,調(diào)整液體至200μL,下室內(nèi)加入500μL含有10%FBS的完全培養(yǎng)液；細胞培養(yǎng)箱內(nèi)遷移24h；棄transwell上、下室內(nèi)液體,甲醇固定10min；1%結(jié)晶紫染色15min；棉簽輕輕擦去ranswell上室內(nèi)側(cè)未遷移的細胞；顯微鏡下隨機選取5個200倍視野,讀取細胞個數(shù),并計算平均數(shù)；實驗重復(fù)六次并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 (四)礦化結(jié)節(jié)染色 牙髓干細胞轉(zhuǎn)染抑制TLR4慢病毒表達載體及空載組慢病毒后,以2×105個細胞接種于六孔板中,待細胞生長達到80%融合時,更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液,將牙髓干細胞向成骨方向分化。誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,分別用茜素紅染色,倒置顯微鏡下觀察并拍照。 (五)RT-PCR 成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,RT-PCR檢測礦化相關(guān)基因OCN、BSP、ALP的表達情況。Trizol抽提牙髓干細胞的總RNA,分光光度計檢測RNA濃度,PrimeScript試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用SYBR法進行PCR擴增,所有基因通過7500RT-PCR儀進行檢測后,用相對定量法計算2-△△CT值代表基因的相對表達強度。實驗重復(fù)3次。 (六)統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,數(shù)據(jù)以x±s表示。轉(zhuǎn)染抑制TLR4慢病毒表達載體后牙髓干細胞中TLR4表達情況的RT-PCR實驗采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析,用Levene's test檢驗方差齊性(檢驗水準a=0.05),如果方差齊則進一步對樣本均數(shù)進行兩兩比較的Bonferroni檢驗,反之,方差不齊,采用近似F檢驗的Welch方法進行分析后Dunnett'T3檢驗進行兩兩比較。MTT采用析因設(shè)計的方差分析確定是否存在交互效應(yīng),進一步組間比較采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。轉(zhuǎn)染抑制TLR4慢病毒表達載體后的transwell實驗、礦化結(jié)節(jié)形成比較和RT-PCR檢測礦化相關(guān)基因的實驗數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析,檢驗水準α=0.05,P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 (一)Si-TLR4慢病毒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與檢驗 實驗構(gòu)建了抑制TLR4慢病毒表達載體。轉(zhuǎn)染牙髓干細胞后,通過RT-PCR檢測證實TLR4mRNA表達量顯著降低(F=196.427, P=0.000), western blot檢測證明TLR4蛋白表達受到抑制。 (二)牙髓干細胞的增殖能力 MTT結(jié)果顯示,抑制TLR4慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染牙髓干細胞后,第3d、5d和7d三個時間點Si-TLR4組細胞增值能力均低于對照組(P=0.000),具有統(tǒng)計學(xué)意義。可見抑制牙髓干細胞TLR4表達后,細胞增殖能力顯著降低。 (三)牙髓干細胞的遷移能力 抑制TLR4慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染牙髓干細胞后,經(jīng)transwell實驗檢測,與對照組相比,經(jīng)過24h的細胞遷移,穿過transwell小室底膜的牙髓干細胞數(shù)量顯著減少(t=12.734,P=0.000),說明抑制TLR4表達后牙髓干細胞遷移能力降低。 (四)牙髓干細胞的礦化能力 下調(diào)TLR4表達后,礦化基因OCN (t=-3.416, P=0.027), BSP(t=-12.344, P=0.000)、ALP (t=-55.815, P=0.000)表達量明顯上調(diào),礦化結(jié)節(jié)形成量增多(t=-56.160,P=0.000)。 結(jié)論 1.TLR4定位表達于牙髓成牙本質(zhì)細胞層及血管周圍組織,且深齲牙髓組織中TLR4表達量較正常牙髓組織增多。TLR4參與了牙髓組織的天然免疫反應(yīng)。 2.組織塊酶消化法可以成功培養(yǎng)人牙髓干細胞,細胞為間充質(zhì)來源,具有向成骨、成軟骨及成脂方向分化的多向分化潛能,經(jīng)鑒定確認為人牙髓干細胞。 3.LPS和變形鏈球菌提取物可以激活人牙髓干細胞中TLR4的表達,并且對牙髓干細胞的增殖能力和礦化能力有抑制作用,對牙髓干細胞遷移能力起促進作用。 4.抑制TLR4表達后,可顯著下調(diào)牙髓干細胞增殖能力、遷移能力,促進牙髓干細胞礦化能力。TLR4對牙髓干細胞的生物學(xué)特性具有調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R781.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 姚麗艷;趙偉;呂紅兵;;3種脫鈣液對牙體牙周聯(lián)合切片H-E染色效果的對比[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年03期

2 程敏;洪麗華;張澤兵;劉樹泰;孫宏晨;李成庫;;牙連牙周組織切片的特殊取材及雙重脫鈣技術(shù)[J];實用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年01期

3 岳靜;高杰;徐樹軍;黃欣;劉影;吳補領(lǐng);;變形鏈球菌超聲提取物對牙髓細胞增殖和天然免疫受體基因mRNA表達的影響[J];實用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2013年01期

4 翟莎菲;阮建平;朱勇;;3種不同脫鈣液對牙齒標本切片免疫組化染色效果的研究[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2011年08期

5 麻丹丹;高杰;吳補領(lǐng);;改良組織塊酶消化法培養(yǎng)人齲損牙髓干細胞的實驗研究[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2011年07期

，

本文編號：1906368