本文選題：骨硬化蛋白 + 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控　； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的在炎癥性骨疾病中,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)為高表達(dá)的炎癥因子之一,可通過調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路參與疾病的進(jìn)展。作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制因子,骨硬化蛋白(Sclerostin,Sost)基因通過調(diào)控經(jīng)典WWnt信號(hào)通路在炎癥環(huán)境下骨組織代謝中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。然而目前對(duì)Sost基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究擬采用TNF-α處理MC3T3-E1小鼠胚胎前成骨細(xì)胞系(MC3T3-E1細(xì)胞)及原代培養(yǎng)的小鼠顱骨成骨細(xì)胞(原代成骨細(xì)胞),并構(gòu)建Sost基因3'端非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)熒光素酶報(bào)告基因載體,以期明確TNF-α是否參與Sost基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。另外,TNF-α可影響多種微小RNA(microRNA,miRNA)在生物體內(nèi)的表達(dá),而研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p及miR-218可特異性結(jié)合到Sost基因的3' UTR并在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Sost對(duì)基因的表達(dá)。為進(jìn)一步探究TNF-α對(duì)Sost基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制,本研究擬采用TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞,并檢測(cè)TNF-α影響下miR-204-5p及miR-218的表達(dá)及功能變化,以明確TNF-α對(duì)Sost基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是否通過特異性miRNAs實(shí)現(xiàn),同時(shí)初步探索其中涉及的信號(hào)通路。方法第一部分:(1)使用不同濃度的TNF-α分別處理MC3T3-E1細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞不同時(shí)間,通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)檢測(cè)Sost基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。(2)采用PCR克隆Sost基因的3'UTR區(qū),并將其連接到熒光素酶報(bào)告基因載體pMIR-REPORT上,所獲得的重組載體命名為pMIR-REPORT-SOST UTR。(3)將pMIR-REPORT-SOST UTR或pMIR-REPORT分別轉(zhuǎn)染至原代成骨細(xì)胞、MC3T3-E1細(xì)胞及NIH3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH3T3細(xì)胞)中,根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的種類將細(xì)胞分別命名為pMIR-REPORT-SOST UTR組和pMIR-REP0RT組,檢測(cè)各組細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平。第二部分:(1)將 pMIR-REPORT-SOST UTR 或 pMIR-REPORT 轉(zhuǎn)染入 MC3T3-E1 細(xì)胞中,根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的種類將細(xì)胞分別命名為pMIR-REPORT-SOST UTR組和pMIR-REPORT組。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后檢測(cè)兩組細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平。在檢測(cè)前使用不同濃度的TNF-α誘導(dǎo)兩組細(xì)胞不同時(shí)間。(2)用不同濃度的TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞不同時(shí)間,通過RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-204-5p及miR-218的表達(dá)水平。(3)將 miR-204-5p 的模擬物(miR-204-5p mimics)轉(zhuǎn)染入 HEK293細(xì)胞及MC3T3-E1細(xì)胞中以實(shí)現(xiàn)miR-204-5p的過表達(dá),轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照miRNA模擬物(mimic NC)的HEK293細(xì)胞及MC3T3-E1細(xì)胞作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后用Ong/ml 或 15ng/ml TNF-α 處理細(xì)胞48小時(shí),以 RT-qPCR 檢測(cè) miR-204-5p的表達(dá)水平。根據(jù)轉(zhuǎn)染物及處理方法的不同將細(xì)胞分別命名為mimic NC組、miR-204-5p 組、mimic NC +TNF-α 組以及 miR-204-5p+TNF-α 組。(4)將 pMIR-REPORT-SOST UTR 和 miR-204-5p mimics 或 mimic NC 共轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞中,根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同將細(xì)胞分為mimic NC組和miR-204-5p組。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后使用0ng/ml或15ng/ml的TNF-α分別處理細(xì)胞48小時(shí),檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平。(5)采用NF-κ B信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082和/或TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞,將細(xì)胞分為Control組、TNF-α組、TNF-α+BAY 11-7082組以及BAY 11-7082組。處理細(xì)胞48小時(shí)后,檢測(cè)Sost基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平,并檢測(cè)miR-204-5p的表達(dá)水平。另外,將pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,使用BAY 11-7082和/或TNF-α處理細(xì)胞48小時(shí),將細(xì)胞分為Control組、TNF-α組、TNF-α+BAY 11-7082組以及BAY 11-7082組,檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)水平。結(jié)果第一部分:(1)在MC3T3-E1細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞中,TNF-α可下調(diào)Sost基因的mRNA的表達(dá)水平,并上調(diào)Sost基因的蛋白表達(dá)水平,且這種調(diào)控作用隨時(shí)間延長(zhǎng)或濃度增加而愈加明顯。(2)成功構(gòu)建pMIR-REPORT-SOST UTR熒光素酶報(bào)告基因載體,經(jīng)測(cè)序鑒定無誤。(3)在原代成骨細(xì)胞及MC3T3-E1細(xì)胞中,pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)水平均顯著低于pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染組。在NIH3T3細(xì)胞中,pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染組和pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)水平無明顯差異。第二部分:(1)使用TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞后,pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)水平仍舊低于pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染組。但是,隨著TNF-α作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng),pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)水平逐步增加。當(dāng)TNF-α的濃度達(dá)到及超過15ng/ml或作用時(shí)間達(dá)到48小時(shí)后,pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)水平雖仍略低于pMIR-REPORT轉(zhuǎn)染組,但差別已無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)在MC3T3-E1細(xì)胞及原代成骨細(xì)胞中,TNF-α可顯著下調(diào)miR-204-5p的表達(dá),但對(duì)miR-218的表達(dá)水平影響不大。(3)在 HEK293 細(xì)胞及 MC3T3-E1 細(xì)胞中,miR-204-5p 組內(nèi) miR-204-5p 的表達(dá)水平遠(yuǎn)大于mimic NC組,而miR-204-5p+TNF-α組內(nèi)miR-204-5p的表達(dá)水平亦遠(yuǎn)大于mimic NC+TNF-α組。另外,miR-204-5p組與miR-204-5p+TNF-α組相比較,miR-204-5p的表達(dá)水平無顯著性差異,提示使用本實(shí)驗(yàn)中的方法過表達(dá)miR-204-5p時(shí),細(xì)胞內(nèi)源性miR-204-5p表達(dá)量的影響可以忽略不計(jì)。(4)將 pMIR-REPORT-SOST UTR 和 miR-204-5p mimics 或 mimic NC 共轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞后,我們發(fā)現(xiàn)miR-204-5p組細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)水平較mimic NC 組降低30%。將 pMIR-REPORT-SOST UTR 和 miR-204-5p mimics或mimic NC共轉(zhuǎn)染入MC3T3-E1細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞施加TNF-α刺激后,我們發(fā)現(xiàn)miR-204-5p組內(nèi)熒光素酶表達(dá)水平較mimic NC組降低28%。加用TNF-α刺激并未顯著改變miR-204-5p對(duì)熒光素酶表達(dá)水平的影響程度,提示miR-204-5p對(duì)Sost基因3' UTR的結(jié)合和抑制功能不受TNF-α刺激的影響。(5)BAY 11-7082不影響TNF-α對(duì)Sost基因mRNA表達(dá)的抑制作用,但可完全逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)Sost基因蛋白質(zhì)表達(dá)的促進(jìn)作用。另外,TNF-α對(duì)miR-204-5p表達(dá)的抑制作用也可被BAY 11-7082不同程度地逆轉(zhuǎn)。在轉(zhuǎn)染了pMIR-REPORT-SOST UTR重組載體的MC3T3-E1細(xì)胞中,TNF-α組的熒光素酶表達(dá)水平顯著高于Control組,但BAY 11-7082完全逆轉(zhuǎn)了 TNF-α對(duì)熒光素酶表達(dá)的促進(jìn)作用。結(jié)論第一部分:TNF-α參與了 Sost基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。將成功構(gòu)建的pMIR-REPORT-SOST UTR轉(zhuǎn)染入不同種類的細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)通過Sost基因3' UTR作用的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制具有細(xì)胞特異性。第二部分:雖然TNF-α對(duì)miR-218的表達(dá)無明顯調(diào)控作用,但TNF-α可通過抑制miR-204-5p的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平增加Sost基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。然而,在MC3T3-E1細(xì)胞中TNF-α并不影響miR-204-5p對(duì)Sost基因3' UTR的結(jié)合及其抑制功能。TNF-α對(duì)Sost基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在相當(dāng)大的程度上是通過NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of miR - 204 - 5p and miR - 218 in the pathogenesis of inflammatory bone diseases . The expression of miR - 204 - 5p and miR - 218 was regulated by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) and Western blot . ( 3 ) The expression levels of miR - 204 - 5p and miR - 218 were detected by RT - qPCR . The expression levels of miR - 204 - 5p and miR - 218 were detected by RT - qPCR . ( 2 ) After 48 hours of transfection , the expression level of luciferase in pMIR - REPORT - SOST - induced transfection group was significantly lower than that of pMIR - REPORT - SOST . Results The expression level of luciferase in the pMIR - REPORT - SOSTRs transfected group was significantly lower than that of pMIR - REPORT - SOST . The expression level of miR - 204 - 5p in the miR - 204 - 5p group was significantly higher than that in the NC group . The transcriptional regulation of the expression of TNF - 偽 on the sost gene is achieved by means of NF - 魏B signal pathway .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781

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5 陳卓;陳s，

本文編號(hào)：1797417