本文選題：牙髓干細(xì)胞 + 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景與目的在口腔組織工程研究中,人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)作為成體干細(xì)胞,都被證實(shí)可以促進(jìn)頜面部硬組織的缺損修復(fù),對于口腔組織再生有較大意義。然而,hDPSCs與hUCMSCs在細(xì)胞來源、體外培養(yǎng)難度、增殖能力、多向分化能力等方面各有優(yōu)劣,在一定程度上限制了他們的研究與應(yīng)用。因而,探索優(yōu)化現(xiàn)有干細(xì)胞如hDPSCs與hUCMSCs等的生物學(xué)特性的方法很有意義。細(xì)胞的旁分泌是指細(xì)胞分泌的各種調(diào)節(jié)因子進(jìn)入到細(xì)胞間隙,對鄰近的其他細(xì)胞的生物學(xué)特性起調(diào)控作用。大量研究表明,干細(xì)胞具備旁分泌功能,其產(chǎn)生的細(xì)胞因子、外泌體等物質(zhì)可以影響到周圍包括組織細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞,對他們的增殖、粘附、凋亡等諸多行為起著不同的影響效應(yīng)。近年來更有學(xué)者發(fā)現(xiàn),不同種類的干細(xì)胞之間同樣可以通過旁分泌作用相互影響增殖、分化等能力,如果能對這些改變加以利用,可能會對推進(jìn)干細(xì)胞在組織工程中的研究進(jìn)程有潛在價值。已有研究證實(shí),hDPSCs和hUCMSCs都具有旁分泌功能,然而二者通過旁分泌對彼此生物學(xué)特性的影響尚不清楚。利用Transwell嵌套建立的細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系是研究旁分泌的有力模型,可以更好模擬體內(nèi)環(huán)境中兩種細(xì)胞同時相互影響的狀態(tài)。因此,本實(shí)驗(yàn)利用Transwell嵌套,于體外建立hDPSCs與hUCMSCs的間接共培養(yǎng)體系,以初步探究間接共培養(yǎng)環(huán)境中hDPSCs與hUCMSCs的旁分泌對彼此增殖及成骨分化能力的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的利用提供理論依據(jù),為優(yōu)化hDPSCs與hUCMSCs在口腔組織工程中的應(yīng)用提供新的思路。材料與方法1.利用酶消化組織塊法分離、培養(yǎng)原代hDPSCs與hUCMSCs;利用流式技術(shù)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)志,利用成骨、成脂誘導(dǎo)檢驗(yàn)多向分化潛能;進(jìn)行hDPSCs與hUCMSCs的傳代與凍存、復(fù)蘇。2.建立hDPSCs-hUCMSCs體外間接共培養(yǎng)體系,并設(shè)置上下層含同種細(xì)胞的體系作為對照。間接共培養(yǎng)處理3d、5d時,通過EdU標(biāo)記法及Western Blot分別測定細(xì)胞的增殖活力及周期相關(guān)蛋白CDK6與CYCLIN A的表達(dá)水平。3.設(shè)置預(yù)先共培養(yǎng)(間接共培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo))組與持續(xù)共培養(yǎng)(間接共培養(yǎng)的同時進(jìn)行成骨誘導(dǎo))組及各自的對照組,通過QRT-RCR和Western Blot技術(shù)分別測定成骨相關(guān)mRNA(Col I,RUNX2,OCN)的表達(dá)水平及成骨相關(guān)蛋白(Col I,RUNX2,OPN)的表達(dá)水平。4.通過Western Blot檢測間接共培養(yǎng)后hDPSCs內(nèi)Akt/mTOR通路核心元件表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.成功分離培養(yǎng)原代hDPSCs與hUCMSCs;hDPSCs與hUCMSCs皆具有間充質(zhì)干細(xì)胞特異表面標(biāo)記并可以成骨、成脂分化;成功進(jìn)行hDPSCs與hUCMSCs的傳代培養(yǎng)與凍存、復(fù)蘇。2.同對照組相比,間接共培養(yǎng)3d及5d后的hDPSCs內(nèi)EdU標(biāo)記陽性率提高、CDK6和CYCLIN A蛋白表達(dá)水平上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;間接共培養(yǎng)3d及5d時的hUCMSCs內(nèi)EdU標(biāo)記陽性率、CDK6和CYCLIN A蛋白表達(dá)水平與對照組無顯著性差異。3.與對照組相比,間接共培養(yǎng)同時進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的hDPSCs內(nèi)的Col I、RUNX2、OCN的mRNA表達(dá)量及Col I、RUNX2、OPN的蛋白表達(dá)量呈不同程度增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;預(yù)先共培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的hDPSCs內(nèi)的Col I、RUNX2、OCN的mRNA表達(dá)量及ColⅠ、RUNX2、OPN的蛋白表達(dá)量呈不同程度增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比,間接共培養(yǎng)同時進(jìn)行成骨誘導(dǎo)及預(yù)先共培養(yǎng)后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的hUCMSCs內(nèi)上述指標(biāo)無顯著性改變。4.與非共培養(yǎng)組相比,間接共培養(yǎng)后hDPSCs內(nèi)Akt、mTOR磷酸化程度增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論與意義在hDPSCs-hUCMSCs體外間接共培養(yǎng)體系中,hUCMSCs的旁分泌作用可促進(jìn)hDPSCs的增殖及成骨分化,而hDPSCs的旁分泌對hUCMSCs的增殖與成骨分化能力未見明顯影響;間接共培養(yǎng)體系中旁分泌影響hDPSCs特性的機(jī)制可能與Akt/mTOR信號通路有關(guān)。此研究結(jié)果表明,間接共培養(yǎng)體系中hUCMSCs的旁分泌對hDPSCs增殖與成骨有正向促進(jìn)效果,這為優(yōu)化hDPSCs與hUCMSCs在組織再生研究中的應(yīng)用提供了新思路。
[Abstract]:In recent years , it has been found that human dental pulp stem cells ( hDPSCs ) and human umbilical cord mesenchymal stem cells ( hUCMSCs ) can be used as adult stem cells to study the biological characteristics of hDPSCs and hUCMSCs . The results showed that the expression levels of the mRNA and the level of protein expression in hDPSCs were significantly increased compared with those in the control group .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R782

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本文編號：1797313