本文選題：小干擾RNA + RNA干擾��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：在前期課題組的臨床和基礎(chǔ)研究中，我們發(fā)現(xiàn)牙的發(fā)育和ClC-7分子密切相關(guān)。一方面表現(xiàn)在CLCN7基因突變所引起的骨硬化癥患者，，可出現(xiàn)牙根發(fā)育不全及牙萌出受阻，部分牙有釉質(zhì)發(fā)育不全等異常表現(xiàn)；另一方面，CLC-7蛋白在胚胎時(shí)期小鼠及出生后P1小鼠的牙胚中均有表達(dá)。所以，我們認(rèn)為ClC-7在牙發(fā)育中可能起到了非常重要的作用。為驗(yàn)證該假說，本實(shí)驗(yàn)采用殼聚糖作為siRNA載體，對(duì)Clcn7-siRNA進(jìn)行包裹，以保護(hù)siRNA免受核酸酶的降解及提高細(xì)胞攝取率；然后通過頜骨局部注射CS-Clcn7-siRNA納米粒溶液的方法，使Clcn7-siRNA分布于特定牙胚及其周圍組織，從而觀察當(dāng)牙胚局部Clcn7基因水平下降時(shí)，其牙胚發(fā)育的特征。 方法： 實(shí)驗(yàn)一：選取新生小鼠上頜第一磨牙為研究對(duì)象，進(jìn)行Cy5.5-siRNA的CS包裹后注射，通過小動(dòng)物活體成像技術(shù)，比較腹腔注射和牙胚局部注射對(duì)牙胚局部的影響，探索和確定一種研究牙胚中基因的頜骨局部注射siRNA的方法。 實(shí)驗(yàn)二：使用建立的頜骨局部注射法將CS-Clcn7-siRNA納米粒溶液局部注射于牙胚周圍，通過石蠟切片HE染色和Micro-CT掃描，觀察注射后不同階段牙發(fā)育的特征，包括牙胚組織的相關(guān)細(xì)胞或結(jié)構(gòu)，如成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)等的形成和變化規(guī)律，驗(yàn)證Clcn7在牙發(fā)育中的作用。 實(shí)驗(yàn)三：用免疫組化的方式比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在CLC-7表達(dá)上的區(qū)別，判斷CS-siRNA納米粒溶液沉默Clcn7的有效性。 結(jié)果： 1.CS-siRNA納米粒溶液腹腔注射后的熒光分布和強(qiáng)度：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光在腹腔內(nèi)的分布范圍先擴(kuò)大，后縮��；強(qiáng)度先增強(qiáng)，后減弱。牙胚處始終沒有檢測(cè)出熒光分布。分離的上頜骨牙胚處不能檢測(cè)出熒光。 2.局部注射法的建立：首先，注射藍(lán)色染料后，探針挖出牙胚成藍(lán)色；其次，小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，于左側(cè)上頜第一磨牙牙胚處注射CS-Cy5.5-siRNA納米粒溶液后，上頜骨牙胚處有熒光；最后，牙胚組織冰凍切片在小動(dòng)物活體成像下顯示牙胚處有熒光，且HE染色結(jié)果顯示牙胚組織結(jié)構(gòu)完好。 3.石蠟切片HE染色和Micro-CT結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組牙胚的成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞受到影響，牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)發(fā)育和牙萌出障礙，牙形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂。 4.P4小鼠石蠟切片免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠CLC-7蛋白在牙胚內(nèi)的成釉細(xì)胞陽性結(jié)果表達(dá)最強(qiáng)，成牙本質(zhì)細(xì)胞和部分的牙乳頭細(xì)胞表達(dá)其次強(qiáng)，星網(wǎng)狀層上的CLC-7表達(dá)相對(duì)較弱。實(shí)驗(yàn)組小鼠CLC-7蛋白在牙胚內(nèi)部分的牙乳頭細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞和星網(wǎng)狀層細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)降低或不表達(dá)。` 結(jié)論： 1.腹腔注射方法目前不能將CS-siRNA有效遞送至頜骨和牙胚組織。局部注射方法具有定位性強(qiáng)和效應(yīng)局限等特征，可用于降低小鼠上頜第一磨牙的局部基因表達(dá)。 2.局部注射CS-Clcn7-siRNA用以沉默牙胚中Clcn7基因的方法可行，此方法為研究小鼠牙胚中其他基因的作用提供了新的研究途徑。 3.Clcn7基因局部沉默后可影響牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的發(fā)育、牙形態(tài)、牙根的發(fā)育和牙的萌出。 本課題通過局部注射CS-Clcn7-siRNA的方法，首次將CS-siRNA應(yīng)用于頜骨局部，有效地觀察了Clcn7基因在局部沉默后對(duì)牙胚發(fā)育的影響。我們認(rèn)為Clcn7基因可能是通過成釉細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞對(duì)牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的形成產(chǎn)生影響；通過對(duì)牙乳頭形態(tài)的影響，參與調(diào)控牙形態(tài)特征；通過影響牙胚周圍組織和細(xì)胞，影響牙根發(fā)育。本課題不僅通過載體包裹siRNA的方法驗(yàn)證了其參與牙胚發(fā)育的調(diào)控，研究了ClC-7在牙胚發(fā)育中的作用；同時(shí)本實(shí)驗(yàn)建立的局部注射siRNA的方法也為研究牙胚中其他基因的生物學(xué)作用提供了新的研究途徑和方法。 雖然局部注射CS-Clcn7-siRNA能夠有效降低牙胚局部CLC-7的表達(dá)降低，并且導(dǎo)致一些牙胚組織和細(xì)胞產(chǎn)生了形態(tài)變化，但其機(jī)制如何，有哪些分子參與調(diào)控其過程，本課題尚未給予答復(fù)，我們將在后續(xù)的研究中針對(duì)這些問題進(jìn)行深入研究。
[Abstract]:In the clinical and basic research of the previous group, we found that the development of teeth is closely related to the ClC-7 molecule. On the one hand, the patients with bone sclerosis caused by CLCN7 gene mutation can appear root dysplasia and tooth eruption, and some teeth have enamel dysplasia. On the other hand, CLC-7 protein is small in the embryonic period. We think that ClC-7 may play a very important role in tooth development. In order to verify this hypothesis, we use chitosan as a siRNA carrier to wrap Clcn7-siRNA in order to protect siRNA from nuclease reduction and increase cell uptake, and then through the jaw bone Bureau. The method of injection of CS-Clcn7-siRNA nanoparticle solution is used to distribute Clcn7-siRNA in specific tooth and surrounding tissues, so as to observe the characteristics of tooth germ development when the local Clcn7 gene level of tooth germ drops.
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本文編號(hào)：1775580