本文選題：舌　切入點(diǎn)：鱗狀細(xì)胞癌　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的口腔頜面部惡性腫瘤,其中又以舌鱗癌最為常見(jiàn)。舌鱗癌惡性程度高,易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者預(yù)后不佳的重要因素,因此對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究將會(huì)為腫瘤的治療及改善患者預(yù)后提供重要的依據(jù)。 分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的進(jìn)步為腫瘤的生物治療創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ),生物治療有望成為繼手術(shù)、化療、放療后的第四種治療方向。腫瘤免疫治療和腫瘤基因治療是腫瘤生物治療的主要手段�；蛑委熓请S著DNA重組技術(shù)的成熟而發(fā)展起來(lái)的,是以改變?nèi)说倪z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療技術(shù),它是通過(guò)一定方式將人正�；蚧蛴兄委熥饔玫腄NA序列導(dǎo)入人體靶細(xì)胞去糾正基因缺陷以發(fā)揮治療作用。雖然現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的多種基因,但人們?nèi)栽诶^續(xù)找尋與口腔鱗癌相關(guān)的新基因,嘗試建立與口腔鱗癌相關(guān)的特異性基因譜學(xué),尋找基因治療的靶點(diǎn),為口腔鱗癌的治療提供科學(xué)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 口腔鱗癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟且復(fù)雜的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位游離是轉(zhuǎn)移的最初始步驟,也是發(fā)生轉(zhuǎn)移的先決條件。因此,如果能制止這一過(guò)程的發(fā)生,將有可能從源頭上控制腫瘤的轉(zhuǎn)移。 2012年,Stephen等研究發(fā)現(xiàn)一種名為FRMD4A(FERM domain-containing protein4A)的蛋白在頭頸癌中起著關(guān)鍵作用,FRMD4A蛋白能促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng),并且FRMD4A蛋白的高表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高度相關(guān)。因而,我們推測(cè)FRMD4A蛋白也可能在口腔鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,FRMD4A蛋白極有可能成為口腔鱗癌新的治療靶點(diǎn)。 長(zhǎng)期以來(lái),有關(guān)FRMD4A的研究鮮見(jiàn)報(bào)道,因而對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能等方面的了解甚少,但近年來(lái)隨著研究的深入,FRMD4A逐漸得到廣泛關(guān)注,FRMD4A基因是近年來(lái)被克隆鑒定的新基因,位于人類染色體10p13。FRMD4A基因表達(dá)產(chǎn)物FRMD4A蛋白與小鼠EpH4上皮細(xì)胞同源,屬FERM超家族成員,含1039個(gè)氨基酸,是一類具有FERM結(jié)構(gòu)域的蛋白。FERM結(jié)構(gòu)域的命名即來(lái)源于紅細(xì)胞中的Band4.1(簡(jiǎn)稱4.1R、four point one)、埃茲蛋白(ezrin)、根蛋白(radixin)與膜突蛋白(moesin)這4種蛋白的首字母。Band4.1是最先被確定的含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白,發(fā)揮連接細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞骨架,協(xié)助維持細(xì)胞形態(tài)和膜穩(wěn)定性的作用。而其他3個(gè)成員主要存在于上皮細(xì)胞富含肌動(dòng)蛋白的皮層區(qū)域和細(xì)胞的外膜,參與細(xì)胞形態(tài)構(gòu)建、細(xì)胞黏附和遷移,調(diào)節(jié)膜蛋白的定位及其相關(guān)功能,調(diào)控細(xì)胞骨架排布,并參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移。FERM結(jié)構(gòu)域廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞多種蛋白中,可作為上游信號(hào),被激活后釋放FERM蛋白活性位點(diǎn),通過(guò)FERM結(jié)合不同配體或調(diào)節(jié)蛋白其他結(jié)構(gòu)域結(jié)合下游信號(hào)分子,參與多種細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)和信息傳遞;或只依賴自身作用于下游因子,積極廣泛地影響多種細(xì)胞生理和病理進(jìn)程,含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白在參與結(jié)構(gòu)組成、蛋白轉(zhuǎn)移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。2008年的全基因組關(guān)聯(lián)性研究以及2012年在亞洲人群中大規(guī)模的全基因組關(guān)聯(lián)研究均發(fā)現(xiàn)FRMD4A基因在人體對(duì)藥物依賴性方面發(fā)揮著重要作用。2010年Ikenouchi證實(shí)FRMD4A基因能編碼骨架蛋白,并調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞粘著連接[8]。 降低含F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域蛋白活性的研究已有報(bào)道,如應(yīng)用siRNA干擾FAK基因表達(dá)可降低乳腺癌AU-565細(xì)胞的遷移能力[9]；應(yīng)用JAK抑制劑CP690、550可減少免疫抑制治療常見(jiàn)的副作用[m]。RNA干擾是一種內(nèi)源基因沉默機(jī)制,由雙鏈RNA介導(dǎo),能特異性地抑制同源基因的表達(dá),最終致使基因沉默。RNA干擾具有高效、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),已成為目前生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最活躍的熱點(diǎn)之一。 目前,關(guān)于FRMD4A在舌鱗癌中的表達(dá)情況和作用在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用qRT-PCR和免疫組化檢測(cè)FRMD4A與舌鱗癌的關(guān)系,并通過(guò)基因沉默逆向驗(yàn)證FRMD4A與舌鱗癌惡性程度的關(guān)系,以探討FRMD4A在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用,為控制舌鱗癌提供新的靶點(diǎn),并為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究包括以下三章： 第一章FRMD4A在舌鱗癌組織中的表達(dá)及意義 目的： 1.探討FRMD4A基因和蛋白在舌鱗癌組織中的表達(dá)情況及意義。 材料和方法： 1.收集廣東省口腔醫(yī)院病理科2010年6月至2013年6月石蠟標(biāo)本108例,其中舌鱗癌組織78例,白斑15例,癌旁正常舌組織(距病灶1.5cm,病理確診為正常上皮)15例。舌鱗癌組織中高分化20例,中分化47例,低分化11例；男40例,女38例；年齡37歲～70歲；TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期31例,Ⅲ期+Ⅳ期47例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。另收集廣東省口腔醫(yī)院頜面外科2013年3月至2013年6月手術(shù)切除舌鱗癌及癌旁正常新鮮舌組織各10例。 2.應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)舌鱗癌及癌旁正常新鮮組織中FRMD4A mRNA的表達(dá)情況。 3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)舌鱗癌、舌白斑和癌旁正常舌組織石蠟切片中FRMD4A蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.qRT-PCR結(jié)果顯示FRMD4A mRNA在舌鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于其在癌旁正常舌組織中的表達(dá)(方差齊性檢驗(yàn)顯示方差不齊,使用校正t檢驗(yàn),P0.01)。 2.免疫組化結(jié)果顯示FRMD4A蛋白陽(yáng)性反應(yīng)主要位于細(xì)胞漿中,呈棕黃色顆粒狀反應(yīng),表達(dá)主要在上皮基底層,并隨腫瘤惡性程度增加有向棘層擴(kuò)散的趨勢(shì)；FRMD4A蛋白在舌鱗癌組織中的表達(dá)(50/78,64.1%)明顯高于白斑組(5/15,33.3%)及癌旁正常組織組(2/15,13.3%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。白斑組與癌旁正常組織組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.舌鱗癌切片中,FRMD4A蛋白在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中(28/35,80.0%)的表達(dá)顯著高于無(wú)轉(zhuǎn)移組(22/43,51.2%),在TNM分期晚期(Ⅲ+Ⅳ)(36/47,76.6%)表達(dá)顯著高于早期者(Ⅰ+Ⅱ)(14/31,45.2%)；FRMD4A蛋白表達(dá)情況與患者年齡、性別、組織分化程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 小結(jié)： 1. FRMD4A mRNA在舌鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于其在癌旁正常舌組織中的表達(dá)。 2. FRMD4A蛋白高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤臨床TNM分期有關(guān),與患者年齡、性別、組織分化程度等因素?zé)o顯著相關(guān)性。 第二章舌鱗癌細(xì)胞系中FRMD4A mRNA的表達(dá)及CAL-27細(xì)胞基因沉默模型的構(gòu)建 目的： 1.檢測(cè)各舌癌細(xì)胞系和正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞中FRMD4A mRNA表達(dá)情況,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考。 2.構(gòu)建沉默F(xiàn)RMD4A基因的細(xì)胞模型,將FRMD4A-siRNA體外轉(zhuǎn)染舌鱗癌CAL-27細(xì)胞,并觀察轉(zhuǎn)染效率及檢測(cè)干擾率。 材料和方法： 1.選取四株惡性程度不同的舌鱗癌細(xì)胞株UM-1、UM-2、SCC-9和CAL-27,并以正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞作為對(duì)照。應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞株中FRMD4A mRNA表達(dá)水平。 2.根據(jù)前期結(jié)果,以舌鱗癌細(xì)胞株CAL-27作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,構(gòu)建沉默F(xiàn)RMD4A基因的細(xì)胞模型,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法,利用Lipofectamine(?) RNAiMAX將小干擾片段FRMD4A-siRNA轉(zhuǎn)染入CAL-27細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡觀察熒光FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率。 3.應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CAL-27細(xì)胞中FRMD4A mRNA表達(dá)變化,Western blot分析轉(zhuǎn)染后FRMD4A蛋白表達(dá)變化情況。 結(jié)果： 1.與正�？谇簧掀ぜ�(xì)胞組相比,各舌鱗癌細(xì)胞株中FRMD4A mRNA相對(duì)表達(dá)量有不同程度上升,其中SSC-9組表達(dá)量為正常組1.2倍,CAL-27組表達(dá)量為正常組1.66倍,UM-2組表達(dá)量為正常組2.68倍,UM-1組表達(dá)量為正常組5.01倍,除SSC-9外,另外三株差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.熒光倒置顯微鏡下觀察顯示,當(dāng)Lipofectamine(?) RNAiMAX終濃度為2.5μL/mL和FRMD4A-siRNA終濃度為50pmol/L時(shí),FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率較高。 3. qRT-PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中,siRNA-2干擾效果最明顯,FRMD4A mRNA相對(duì)空白組降低了94%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；Western blot結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中,siRNA-2使FRMD4A蛋白表達(dá)下調(diào),抑制率為71.6%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 小結(jié)： 1. FRMD4A mRNA在各舌鱗癌細(xì)胞株中有不同程度的高表達(dá)。 2. FRMD4A-siRNA能有效降低FRMD4A在舌鱗癌CAL-27細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 第三章沉默F(xiàn)RMD4A基因?qū)ι圜[癌CAL-27細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 目的： 1.探討FRMD4A在舌鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用。 材料和方法： 1.構(gòu)建沉默F(xiàn)RMD4A基因的CAL-27細(xì)胞模型,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。 2.沉默F(xiàn)RMD4A基因后,應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)FRMD4A對(duì)CAL-27細(xì)胞體外增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默F(xiàn)RMD4A基因?qū)AL-27細(xì)胞周期分布的影響。 3.沉默F(xiàn)RMD4A基因后,應(yīng)用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FRMD4A對(duì)CAL-27細(xì)胞體外遷移侵襲能力的影響。 結(jié)果： 1.CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后在24h及48h檢測(cè)時(shí)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體外增殖活性顯著降低,而轉(zhuǎn)染72h后,隨著RNA干擾效應(yīng)減弱,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性與對(duì)照組相比,差異不顯著。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G1期分布比率上升,G2+S期比率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示劃痕48h后,空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組細(xì)胞向劃痕邊緣爬行速度快,劃痕寬度明顯變窄,細(xì)胞甚至已填滿劃痕區(qū)域,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞爬行速度較慢。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少。 小結(jié)： 1.沉默F(xiàn)RMD4A基因的表達(dá)可降低CAL-27細(xì)胞的體外增殖能力,造成細(xì)胞G1期阻滯現(xiàn)象。 2.沉默F(xiàn)RMD4A基因的表達(dá)可降低CAL-27細(xì)胞體外遷移和侵襲能力。 全文結(jié)論： 1. FRMD4A mRNA在舌鱗癌組織中的表達(dá)顯著高于其在癌旁正常舌組織中的表達(dá)；FRMD4A蛋白高表達(dá)與舌鱗癌患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM晚期密切相關(guān)。 2. FRMD4A mRNA在各舌鱗癌細(xì)胞株中有不同程度的高表達(dá)；FRMD4A-siRNA能有效降低FRMD4A在舌鱗癌CAL-27細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 3.體外沉默CAL-27細(xì)胞的FRMD4A基因可降低細(xì)胞的增殖活性、遷移能力和侵襲能力,使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。
[Abstract]:Oral squamous cell carcinoma is the most common malignant tumor of oral and maxillofacial region , and tongue squamous cell carcinoma is the most common . The malignant degree of tongue squamous cell carcinoma is high and easy to recur .

The progress of molecular biology and genetic engineering technology has created a good foundation for the biological treatment of tumor , and the biological treatment is expected to be the fourth treatment direction after surgery , chemotherapy and radiotherapy . The gene therapy is a biological medical treatment technology based on the change of human genetic material .

Recurrence of oral squamous cell carcinoma is a multi - step and complex process . Tumor cells are free from the primary site as the most initial step of metastasis and a prerequisite for metastasis . Therefore , if this process can be stopped , it is possible to control the metastasis of the tumor from the source .

In 2012 , Stephen et al . found that a protein called FRMD4A ( FERM domain - containing protein 4A ) plays a key role in head and neck cancer , and FRMD4A protein can promote cancer cell growth , and high expression of FRMD4A protein is highly correlated with the risk of recurrence of head and neck squamous cell carcinoma . Therefore , we hypothesized that the FRMD4A protein may also play an important role in the invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma , and that the FRMD4A protein is highly likely to be a new therapeutic target for oral squamous cell carcinoma .

The invention relates to a novel gene with an FERM domain , which is characterized by that the FRMD4A gene can be used as an upstream signal , plays an important role in regulating the cell morphology and membrane stability , and plays an important role in regulating the cell morphology and membrane stability by binding downstream signal molecules in combination with different ligands or other domains of the protein .

Studies on reducing the activity of the protein containing the FERM BP domain have reported that , for example , the application of siRNA to interfere with the expression of VEGF can reduce the migration ability of the breast cancer AU - 565 cells .
The use of JAK inhibitor CP690 , 550 can reduce the side effects of immunosuppressive therapy . RNA interference is an endogenous gene silencing mechanism , which is mediated by double - stranded RNA , which can specifically inhibit the expression of homologous genes , and eventually lead to gene silencing . RNA interference has the characteristics of high efficiency , stability and strong specificity , and has become one of the most active hot spots in the field of biomedical research .

At present , the expression and function of FRMD4A in tongue squamous cell carcinoma have not been reported at home and abroad . The relationship between FRMD4A and tongue squamous cell carcinoma is first detected by qRT - PCR and immunohistochemistry , and the relationship between FRMD4A and malignant degree of tongue squamous cell carcinoma is verified by gene silencing .

This study consists of the following three chapters :

The expression of FRMD4A in tongue squamous cell carcinoma and its significance

Purpose :

1 . To investigate the expression of FRMD4A gene and protein in tongue squamous cell carcinoma .

Materials and methods :

1 . A total of 108 paraffin specimens were collected from June 2010 to June 2013 , including 78 cases of tongue squamous cell carcinoma , 15 cases of white spot , 15 cases with normal tongue tissues ( 1.5 cm away from focus and 1 . 5 cm in pathology ) , 15 cases of high differentiation in tongue squamous cell carcinoma , 47 cases of middle differentiation and 11 cases of low differentiation .
40 male and 38 female ;
Age ranged from 37 to 70 years ;
TNM stage 鈪，

本文編號(hào)：1703010