發(fā)布時間：2018-04-01 06:28

  本文選題：自噬　切入點：凋亡　出處：《武漢大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分小鼠牙胚發(fā)育中自噬的時空性表達模式分析 目的：自噬是一種由溶酶體和胞內(nèi)體介導的細胞自我降解過程,在細胞增殖、分化和死亡過程中發(fā)揮重要作用。近來研究表明,自噬與凋亡緊密關聯(lián)參與胚胎的發(fā)育過程。本研究旨在探索小鼠牙胚發(fā)育中自噬的時空性表達模式,并初步分析其與凋亡的相關性。 方法：收集不同發(fā)育時期的小鼠下頜第一磨牙牙胚,實時定量RT-PCR和Westernblot分析自噬相關分子的mRNA和蛋白表達水平；免疫組織化學定位自噬相關蛋白LC3和Beclin1；自噬及凋亡相關分子免疫熒光雙標及三標技術共定位(LC3/TUNEL; LC3/Beclinl/Cl-Caspase-3)分析自噬和凋亡的位置關系；進一步通過透射電鏡觀察自噬小體與凋亡的超微結構及其定位分布。 結果：實時定量RT-PCR和Western blot結果顯示,在小鼠牙胚發(fā)育的不同時期均有自噬相關基因(Atg5, Atg7, Atg12)和蛋白(Atg5-Atg12復合物,Beclin1的全片段及剪切片段及LC3Ⅱ)的表達。免疫組織化學分析表明,在牙胚發(fā)育的不同時期,LC3定位于牙胚的不同部位。在胚胎期,LC3在成釉器和牙乳頭均有表達,尤其是E14.5時期的頸環(huán)和原發(fā)性釉節(jié)(PEK)面向間充質(zhì)的部分；而出生后期,LC3則主要表達于成釉器、成牙本質(zhì)細胞、牙囊細胞及Hertwig's上皮根鞘。與此同時,Beclin1的表達模式與LC3不完全一致,主要體現(xiàn)在Beclin1有部分胞核表達,并且其在胚胎期主要分布于成釉器。免疫熒光雙標捕獲LC3和TUNEL信號存在部分共定位,主要在E14.5的PEK、E16.5的中間層和外釉上皮、P5.5的中間層和星網(wǎng)狀層。免疫熒光三標發(fā)現(xiàn)在E14.5原發(fā)性釉節(jié)中,Beclin1、LC3和C1-Caspase-3相互存在部分共定位,且其中存在Beclin1+LC3+Caspase-3+三陽性的細胞。透射電鏡觀察進一步證實,在E14.5的原發(fā)性釉節(jié)和P5.5的星網(wǎng)狀層,均可見部分自噬小體和凋亡細胞核有共定位。 結論：自噬存在于小鼠牙胚發(fā)育的過程中,且與凋亡存在部分共定位,推測其可能通過Beclin1與凋亡相互作用,共同調(diào)控牙形成。本研究為進一步闡明牙發(fā)育的機制提供了基本資料。 第二部分自噬參與SDF-1a介導的牙髓干細胞遷移及異位牙髓再生 目的：基于再生醫(yī)學的發(fā)展,牙髓根尖周病治療衍生出“牙髓再生治療”理念：即構建具有生物活性的牙髓組織,恢復牙體組織的生命和活力。SDF-1α隸屬于CXC趨化因子亞家族,在造血干細胞和間充質(zhì)干細胞的募集、遷移以及分化中發(fā)揮關鍵作用。近來研究發(fā)現(xiàn),SDF-1α可促進犬牙髓干細胞遷移,并且膠原負載SDF-1α整合犬牙髓干細胞(Denal pulp stem cells, DPSCs)可有效實現(xiàn)牙髓再生。但有關SDF-1α介導牙髓再生的機制尚不明確。第一部分實驗結果顯示自噬存在于發(fā)育中的牙乳頭和成牙本質(zhì)細胞中,提示自噬可能參與牙髓再生。本實驗旨在探討自噬對SDF-1α介導DPSCs遷移的調(diào)控效應；進一步應用絲素蛋白支架負載SDF-1α并整合DPSCs建立異位牙髓再生模型,探討自噬在再生牙髓樣組織中的表達及作用。 方法：有限稀釋法原代培養(yǎng)人牙髓干細胞,克隆形成試驗、細胞免疫熒光、流式細胞術和多向分化檢測鑒定其干細胞特性。CCK8、劃痕和Transwell試驗,檢測SDF-1α對DPSCs細胞活力和遷移的影響；細胞免疫熒光檢測SDF-1α刺激下DPSCs細胞骨架和黏著斑蛋白的改變。細胞免疫熒光、Western blot及透射電鏡檢測SDF-1α對DPSCs自噬表達水平的影響,并應用自噬抑制劑及激活劑探討自噬對SDF-1α介導DPSCs遷移的調(diào)控效應。冷凍干燥法制取多孔絲素蛋白支架并負載SDF-1α,掃描電鏡和傅里葉紅外光譜檢測其表面形貌及物理化學特征。通過將支架整合經(jīng)過預處理的牙根段(牙根段-絲素蛋白支架復合體)以模擬牙髓微環(huán)境,接種DPSCs后,體外培養(yǎng)后掃描電鏡觀察細胞的形態(tài)或裸鼠皮下移植,建立異位牙髓再生模型。HE、Masson三色法、苦昧酸-天狼星紅染色、、Vestern blot、免疫組織化學以及免疫熒光對再生組織進行組織學形態(tài)及增殖、成血管、成神經(jīng)、成骨、成牙相關指標檢測。Western blot、免疫組織化學、透射電鏡以及免疫熒光共定位進一步檢測自噬相關分子及其與血管內(nèi)皮標記分子的共定位特點。 結果：分離培養(yǎng)的DPSCs表達間充質(zhì)干細胞表面標記、具有克隆形成能力以及多向分化潛能。SDF-1α(0-200ng/ml)對DPSCs的細胞活力基本無影響。值得注意的是,SDF-1α可劑量依賴性促進DPSCs遷移,伴隨細胞骨架改建以及黏著斑組裝(Vincullin, p-Paxillin, p-FAK)。與此同時,SDF-1α可激活DPSCs自噬相關蛋白(Beclin I, LC3, Atg5-Atg12復合體)表達及自噬小體的形成。并且,在SDF-1α刺激DPSCs前用自噬抑制劑或激活劑預處理,發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑(3-MA,氯喹)預處理,可不同程度阻斷SDF-1α激發(fā)的DPSCs遷移；而自噬激活劑(Rapamycin)預處理則使DPSCs遷移水平進一步提升。絲素蛋白支架孔徑約為200±46μm,負載SDF-1α后并未改變支架的分子構象。DPSCs在上述支架可表現(xiàn)良好的鋪展形態(tài)、增殖并伴隨細胞外基質(zhì)的分泌。牙根段-負載SDF-1α的絲素蛋白支架復合體整合人牙髓干細胞在裸鼠皮下可形成牙髓樣組織,表現(xiàn)為富含血管和類似正常牙髓的新生膠原纖維形成,且牙本質(zhì)壁沉積有DSP表達陽性的新生礦化組織。值得注意的是,再生組織中存在自噬及相關分子(Atg5,LC3)表達和自噬小體的形成。此外,LC3和血管內(nèi)皮標記分子CD31呈現(xiàn)部分共定位的特征,且血管內(nèi)皮超微結構中可見自噬小體的存在,提示自噬可能參與了異位再生牙髓組織的成血管過程。再生牙髓樣組織由供體細胞和宿主細胞共同組成,且在無細胞移植組,SDF-1α亦可有效募集宿主細胞形成含有血管和新生膠原纖維的結締組織,伴隨自Atg5和LC3的表達。 結論：絲素蛋白支架負載SDF-1α可有效實現(xiàn)異位牙髓再生；自噬可能通過正向調(diào)控SDF-1α介導的DPSCs遷移及參與自體干細胞募集參與牙髓再生的過程。 第三部分“干細胞歸巢”下SDF-1α介導的犬成熟恒牙原位牙髓再生及自噬表達相關研究 目的：“干細胞歸巢”模式,即通過有效募集機體內(nèi)源性干細胞作為種子細胞,從而實現(xiàn)組織/器官再生。最近有學者提出基于“干細胞歸巢”可初步實現(xiàn)犬成熟恒牙原位牙髓再生,然而其再生組織呈現(xiàn)廣泛彌散性鈣化,與正常牙髓相去甚遠。我們第二部分中的結果初步提示,在無DPSCs移植情況下,SDF-1α可通過募集宿主細胞在牙根段內(nèi)生成富含血管和膠原的結締組織。本實驗旨在基于“干細胞歸巢”模式,進一步探索建立SDF-1α介導的犬成熟恒牙原位牙髓再生模型,比較研究其再生組織與正常牙髓的形態(tài)特點以及自噬相關分子表達水平。 方法：選取比格犬根尖孔閉合恒牙,牙髓暴露法誘導根尖周炎,根管預備消毒后針扎根尖出血,移植入負載SDF-1α的絲素蛋白支架,以單純針扎出血誘導根管內(nèi)形成血凝塊為對照,建立成熟恒牙牙髓原位再生模型。HE、Masson三色法和苦味酸-天狼星紅染色分析再生組織形態(tài)特點；免疫組織化學染色進一步檢測自噬相關分子LC3和Atg5的表達。 結果：在犬成熟恒牙原位牙髓再生模型中,血凝塊對照組和負載SDF-1α的絲素蛋白支架組根管內(nèi)均可見到組織形成,含部分炎性細胞。血凝塊對照組再生組織中主要為沿牙本質(zhì)壁形成的較厚的牙骨質(zhì)樣組織,髓腔內(nèi)有大小不一的骨樣組織及少量含有小血管的結締組織。負載SDF-1α的絲素蛋白支架組再生組織為牙髓樣組織,表現(xiàn)為血運較豐富的結締組織,膠原纖維排列方式與正常牙髓類似,髓腔內(nèi)未見骨樣組織,沿牙本質(zhì)壁形成較薄的礦化組織。而礦化組織表面可見排列均勻的單層細胞,并有纖維樣結構深入其中。此外,在犬正常牙髓中,Atg5基本無表達,LC3僅表達于成牙本質(zhì)細胞；而在再生組織中,Atg5和LC3均有表達,且負載SDF-1α的絲素蛋白支架組表達水平高于血凝塊對照組。 結論：基于“干細胞歸巢”模式,絲素蛋白支架負載SDF-1α可有效實現(xiàn)原位牙髓再生,再生組織與正常牙髓類似,并伴隨自噬相關分子表達升高。本研究將為牙髓再生的臨床轉化提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R781.3

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本文編號：1694350