本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：骨形態(tài)發(fā)生蛋白9　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景和目的自體骨、同種異體骨、異種骨等各類來(lái)源的移植物常被用于修復(fù)骨折、骨缺損等臨床常見(jiàn)疾病,但目前由于二次手術(shù)痛苦、傳播感染風(fēng)險(xiǎn)、宿主整合困難等問(wèn)題,使此類修復(fù)方式存在一定的局限性。而采用組織工程技術(shù)可構(gòu)建骨組織,且結(jié)構(gòu)及生理功能與人體骨類似,能彌補(bǔ)甚至解決骨折、骨缺損治療產(chǎn)生的臨床局限;其中細(xì)胞和生長(zhǎng)因子作為復(fù)合物構(gòu)建的核心要素,在修復(fù)或再造組織、器官的過(guò)程中起到了決定性作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來(lái)源廣泛,因具有強(qiáng)大的增殖作用與多向分化功能而成為各類研究中的種子細(xì)胞。目前組織工程技術(shù)通過(guò)運(yùn)用各類MSCs在臨床試驗(yàn)當(dāng)中取得了一定成果,尤其在對(duì)口腔頜面部外傷、腫瘤等引起的頜骨骨折、缺損研究中發(fā)現(xiàn),MSCs能增加新骨形成,并減少自體骨愈合的時(shí)間。但大量研究顯示,僅使用MSCs發(fā)揮的生物學(xué)作用過(guò)于單一,往往需要整合各類高效的生長(zhǎng)因子從而更好地促進(jìn)成骨。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族中最重要的生長(zhǎng)因子之一,目前有超過(guò)20名BMPs成員在人體中被發(fā)現(xiàn)。研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有強(qiáng)大的成骨能力,且成骨效應(yīng)優(yōu)于曾被批準(zhǔn)用于臨床治療的BMP2與BMP7,但當(dāng)前對(duì)其成骨機(jī)制的了解還不夠深入。同時(shí)在臨床研究中,復(fù)合何種載體材料以及如何精確控制藥物遞送系統(tǒng)來(lái)輔助BMP9全面、有效地形成骨組織是現(xiàn)階段亟待解決的問(wèn)題。骨組織的形成往往伴隨著復(fù)雜的生物學(xué)機(jī)制,其中離不開(kāi)神經(jīng)、血管等共同發(fā)揮作用,研究證實(shí)骨組織當(dāng)中的各類神經(jīng)纖維可支配骨髓、骨膜,并能通過(guò)長(zhǎng)入骨痂在骨愈合的過(guò)程中扮演著重要角色。而神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,除了對(duì)中樞神經(jīng)與外周神經(jīng)元各項(xiàng)生理機(jī)能進(jìn)行調(diào)節(jié)外,也能夠誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入未成熟的骨組織及骨痂。近年來(lái)各項(xiàng)研究表明,NGF具有促進(jìn)成骨的能力,并能夠改善骨組織形成中的血管微環(huán)境,特別是在對(duì)下頜骨缺損修復(fù)、種植體周圍骨愈合、牙體礦化發(fā)育等口腔頜面部研究中常被作為復(fù)合支架的關(guān)鍵生長(zhǎng)因子。但NGF究竟是通過(guò)在骨組織中支配神經(jīng)纖維還是刺激細(xì)胞或多肽類物質(zhì)來(lái)主要進(jìn)行成骨的機(jī)理還不甚清楚,因此,如何在組織工程技術(shù)中有效地利用NGF配合成骨值得深入研究。綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)比單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用BMP9與NGF刺激C3H10T1/2骨向分化,觀察此過(guò)程中經(jīng)典成骨標(biāo)志物的表達(dá)模式,并初步探討B(tài)MP9與NGF在MSCs骨向分化中的作用,為口腔頜面部再生研究及組織工程領(lǐng)域中的多細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法1.細(xì)胞培養(yǎng)C3H10T1/2細(xì)胞接種于250ml培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的H-DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);293T細(xì)胞接種于100mm培養(yǎng)皿,用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM:F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞均置于37℃、5%CO2條件下孵育,待生長(zhǎng)密度達(dá)80%時(shí),用0.25%胰酶消化傳代,選取狀態(tài)良好的細(xì)胞代數(shù)用以實(shí)驗(yàn)。2.不同濃度NGF對(duì)C3H10T1/2骨向分化能力的測(cè)定待C3H10T1/2生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%時(shí),誘導(dǎo)其骨向分化,同時(shí)分別加入終濃度為10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml的3種NGF進(jìn)行刺激作為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組不用NGF處理。分別于處理后3d檢測(cè)骨向分化早期相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá),7d檢測(cè)ALP染色情況,21d檢測(cè)骨向分化晚期特征鈣結(jié)節(jié)的形成。3.外源性BMP9對(duì)C3H10T1/2內(nèi)BMP9的表達(dá)調(diào)控首先利用重組腺病毒Ad-BMP9與Ad-GFP分別感染293T進(jìn)行擴(kuò)增,反復(fù)擴(kuò)增后用以轉(zhuǎn)染C3H10T1/2,并用熒光顯微鏡觀察、甄選滴度較高的病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待C3H10T1/2生長(zhǎng)密度達(dá)50%時(shí),按腺病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)?shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染適量Ad-BMP9,對(duì)照組轉(zhuǎn)染適量Ad-GFP,并密切關(guān)注24h內(nèi)C3H10T1/2內(nèi)熒光表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后12h對(duì)兩組C3H10T1/2進(jìn)行收集,并檢測(cè)BMP9的mRNA表達(dá)情況。4.BMP9與NGF對(duì)C3H10T1/2骨向分化不同時(shí)期成骨標(biāo)志物的影響4.1骨向分化早期標(biāo)志物檢測(cè):待C3H10T1/2生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%時(shí),誘導(dǎo)其骨向分化,同時(shí)按不同處理因素將實(shí)驗(yàn)分為(1)GFP組:使用綠色熒光進(jìn)行空白對(duì)照;(2)NGF組:單獨(dú)使用NGF刺激細(xì)胞;(3)BMP9組:單獨(dú)使用Ad-BMP9刺激細(xì)胞;(4)NGF+BMP9組:聯(lián)合使用NGF與Ad-BMP9刺激細(xì)胞。分別于處理后3h,12h,24h,48h檢測(cè)骨向分化早期相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá),3d,7d檢測(cè)ALP活性及染色情況。4.2骨向分化晚期標(biāo)志物檢測(cè):對(duì)GFP組、NGF組、BMP9組、NGF+BMP9組按上述不同因素處理,持續(xù)刺激C3H10T1/2骨向分化。分別于處理后9d,12d檢測(cè)骨向分化晚期相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá),14d,21d檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成的染色程度。結(jié)果1.RT-PCR結(jié)果顯示:骨向分化3d后,采用10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml NGF刺激的實(shí)驗(yàn)組中Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于無(wú)NGF刺激的對(duì)照組(P0.001),且NGF濃度為10ng/ml時(shí),Runx2表達(dá)量最高(P0.01或P0.001)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示:骨向分化3d后,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均檢測(cè)到Runx2的蛋白表達(dá),且NGF濃度為10ng/ml時(shí),Runx2的蛋白表達(dá)最為明顯。ALP染色結(jié)果顯示:骨向分化7d后,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的部分細(xì)胞中均呈現(xiàn)出藍(lán)色深染物,且NGF濃度為10ng/ml時(shí),染色程度最為密集。茜素紅染色結(jié)果顯示:骨向分化21d后,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的部分細(xì)胞中均可見(jiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)形成,且NGF濃度為10ng/ml時(shí),鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量最多。2.擴(kuò)增后的重組腺病毒具備良好活性,Ad-BMP9與Ad-GFP轉(zhuǎn)染C3H10T1/2后可在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá),并測(cè)得最適感染量為4μl/ml,感染效率約為30%。C3H10T1/2經(jīng)Ad-BMP9轉(zhuǎn)染12h后,已能通過(guò)熒光顯微鏡觀察到部分細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。RT-PCR的結(jié)果進(jìn)一步顯示:感染12h后,經(jīng)Ad-BMP9轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)BMP9 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增高,為對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)BMP9 mRNA的5.14倍(P0.001)。3.RT-PCR結(jié)果顯示:骨向分化3h后,NGF組,BMP9組,NGF+BMP9組中Runx2與Col I的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P0.05或P0.01或P0.001),并在NGF+BMP9組中表達(dá)最高(P0.001);骨向分化12h后,各實(shí)驗(yàn)組中Runx2與Col I的mRNA相對(duì)表達(dá)量依然明顯高于對(duì)照組(P0.05或P0.001),同樣在NGF+BMP9組中表達(dá)最高(P0.001)。Western blot和Quantity One灰度值掃描結(jié)果顯示:骨向分化24h后,各實(shí)驗(yàn)組中Runx2的蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P0.05或P0.001),并在NGF+BMP9組中表達(dá)最強(qiáng)(P0.001);骨向分化48h后,各實(shí)驗(yàn)組中Runx2的蛋白表達(dá)依然明顯高于對(duì)照組(P0.001),同樣在NGF+BMP9組中表達(dá)最強(qiáng)(P0.001)。ALP活性結(jié)果顯示:骨向分化3d后,各實(shí)驗(yàn)組中ALP活性強(qiáng)度均顯著高于對(duì)照組(P0.001),并在NGF+BMP9組中表達(dá)最強(qiáng)(P0.001);骨向分化7d后,各實(shí)驗(yàn)組中ALP活性強(qiáng)度依然顯著高于對(duì)照組(P0.001),同樣在NGF+BMP9組中表達(dá)最強(qiáng)(P0.001)。ALP染色結(jié)果顯示:各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在骨向分化3d與7d后,部分細(xì)胞中均呈現(xiàn)出藍(lán)色或藍(lán)黑色深染物,以NGF+BMP9組最為密集,且隨時(shí)間推移每組深染物的顏色與范圍分別呈明顯加深與擴(kuò)大趨勢(shì)。4.RT-PCR結(jié)果顯示:骨向分化9d后,各實(shí)驗(yàn)組中OPN的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P0.05或P0.01或P0.001),并在NGF+BMP9組中表達(dá)最高(P0.001)。Western blot和Quantity One灰度值掃描結(jié)果顯示:骨向分化12d后,各實(shí)驗(yàn)組中OPN的蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P0.05或P0.001),并在NGF+BMP9組中表達(dá)最強(qiáng)(P0.001)。茜素紅染色結(jié)果顯示:骨向分化14d與21d后,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的部分細(xì)胞中均可見(jiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)形成,以NGF+BMP9組最為明顯,且隨時(shí)間推移每組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量呈明顯增多趨勢(shì)。結(jié)論1.NGF在早期與晚期分別促進(jìn)了相應(yīng)成骨標(biāo)志物的表達(dá),說(shuō)明其能增強(qiáng)C3H10T1/2骨向分化的能力。當(dāng)NGF濃度為10ng/ml時(shí),對(duì)C3H10T1/2骨向分化的增強(qiáng)作用最為明顯,推測(cè)NGF在對(duì)C3H10T1/2骨向分化的增強(qiáng)過(guò)程中存在閾值,過(guò)量NGF可能會(huì)對(duì)骨向分化造成抑制。2.BMP9與NGF在C3H10T1/2骨向分化早期增強(qiáng)了經(jīng)典成骨標(biāo)志物的表達(dá),說(shuō)明二者具有協(xié)同促進(jìn)作用。特別是Runx2與Col I的mRNA早在分組處理后3h能被檢測(cè)到明顯的表達(dá)上調(diào),說(shuō)明BMP9與NGF促進(jìn)成骨的相關(guān)信號(hào)通路可能在刺激伊始即被激活。3.BMP9與NGF增強(qiáng)了C3H10T1/2晚期成骨標(biāo)志物的表達(dá),聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)大量鈣化結(jié)節(jié)的形成,進(jìn)一步說(shuō)明了二者對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化具有協(xié)同促進(jìn)作用。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein ( BMPs ) is one of the most important growth factors of transforming growth factor - 尾 ( TGF - 尾 ) superfamily . In this study , it is not very clear that NGF has been used as the key growth factor in bone healing process . In addition , it has been shown that NGF has the ability to promote bone formation , and it can improve the vascular microenvironment in bone tissue formation . ( 2 ) NGF group : NGF and Ad - BMP9 were used to test the mRNA transcription level and protein expression of the early related genes of bone . The results showed that the expression of Runx2 mRNA was the highest when NGF concentration was 10ng / ml . Compared with the control group ( P0.05 or P0.01 ) , the expression of the mRNA of Runx2 and Col I in each experimental group was significantly higher than that in the control group ( P0.05 or P0.01 ) . 3 . BMP9 and NGF enhanced the expression of C3H10T1 / 2 late osteogenic markers .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R782

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 趙丹;羅進(jìn)勇;;BMP9促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2成骨分化的研究[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年16期

2 鮑艷娜;黃峰;湯曉飛;溫穎;單兆臣;曾劍玉;;神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)口腔種植體早期骨結(jié)合影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年11期

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本文編號(hào)：1670426