發(fā)布時(shí)間：2018-03-25 21:11

  本文選題：乳鐵蛋白　切入點(diǎn)：脂多糖　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景及目的 牙周病是一種感染性疾病,致病微生物、易感宿主和局部環(huán)境改變是牙周病發(fā)生和發(fā)展的三大因素。經(jīng)典理論認(rèn)為,牙周病是由牙菌斑及其產(chǎn)物(如脂多糖)作用于牙周組織,并通過激活宿主的炎癥免疫反應(yīng),使牙周組織發(fā)生炎癥或壞死的一種慢性或急慢性反復(fù)發(fā)作的進(jìn)展性炎癥性疾病。近年來,宿主的炎癥免疫反應(yīng)在牙周病進(jìn)展中的作用已得到充分研究和肯定。Toll樣受體家族(Toll like receptors, TLRs)是一種進(jìn)化保守模式識(shí)別受體,它們通過識(shí)別病原體相關(guān)的分子位點(diǎn),來激活先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子,進(jìn)而啟動(dòng)后天免疫系統(tǒng)反應(yīng)。Toll樣受體能識(shí)別多種病原體相關(guān)分子模式,Toll樣受體家族中不同的Toll樣受體識(shí)別不同的配體,其中TLR-2和TLR-4參與了細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LP S)的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),在LPS激發(fā)的炎癥免疫中起著至關(guān)重要的作用,是細(xì)菌破壞細(xì)胞的關(guān)鍵途徑。 牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周病的主要致病菌,在病情持續(xù)加重和治療后復(fù)發(fā)的牙周病患者中其檢出率增高。P.gingivalis分泌的毒力因子LPS,在CD14、LBP、MD-2等分子的協(xié)同下被TLR-4和TLR-2所識(shí)別,然后通過髓樣分化因子-88(myeloid differentiation-88,MyD-88)依賴和MyD-88非依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),再誘發(fā)胞內(nèi)一系列的相關(guān)因子反應(yīng),從而合成IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1、IL-12以及IFN-γ等細(xì)胞炎癥因子,促使牙周組織炎癥免疫反應(yīng)持續(xù)加重或反復(fù)發(fā)作。 牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周膜中最重要的細(xì)胞,它具有分泌和收縮膠原、形成礦化、再生增殖和附著的生物學(xué)特性,是牙周組織再生修復(fù)的基礎(chǔ),同時(shí)也是形成牙周新附著的主要來源。在牙周病發(fā)生發(fā)展過程中牙周膜成纖維細(xì)胞受到炎癥侵襲,發(fā)生病理性壞死或凋亡,最終導(dǎo)致牙周支持組織喪失,牙齒松動(dòng)。故而促使牙周膜成纖維細(xì)胞有效地在根面附著、增殖和分化,使牙周組織生理和功能性再生,是牙周病治療的根本。 乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)是一種存在于人體多種組織中的糖蛋白,具有抗細(xì)菌、真菌及病毒等特性,參與構(gòu)成非特異性免疫系統(tǒng),也是口腔唾液防御系統(tǒng)的重要組成部分。乳鐵蛋白可以直接對(duì)抗細(xì)菌的增殖和附著,或是通過干擾細(xì)菌LPS引發(fā)的TLR免疫反應(yīng)來抑制內(nèi)毒素毒性,進(jìn)而抑制炎癥發(fā)展。此外它還可以減少由LPS引發(fā)的炎癥因子的分泌。抑制LPS激發(fā)的TLR反應(yīng)從而調(diào)控相關(guān)的炎癥反應(yīng),是近年來研究炎癥治療方法的熱點(diǎn)。本研究旨在探討乳鐵蛋白對(duì)經(jīng)LPS刺激的人牙周膜細(xì)胞表達(dá)TLR-4和TLR-2及其分泌IL-6和IL-8的影響,初步探索乳鐵蛋白在牙周病免疫調(diào)節(jié)治療方面的作用。 第一章人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定 目的體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs),觀察人牙周膜細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特點(diǎn)及其鑒定。 方法 1.取15-22歲正畸志愿者牙周及牙體均健康的前磨牙,無菌條件下刮取根中三分之一牙周膜組織,組織塊酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)并傳代。取原代生長的hPDLCs及培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞,倒置相差顯微鏡觀察其生長形態(tài)及特征。2.取第3代hPDLCs,消化成密度為1×106·mL-1的單細(xì)胞懸液,分別加入小鼠抗人CD105、CD29、CD44、CD90單抗,室溫孵育1h；洗滌后分別加入羊抗鼠Ig-FITC,室溫避光45min; PBS洗滌3次,棄上清,加PBS重懸,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子表型。 3.Ⅰ、Ⅳ型膠原的半定量PCR檢測(cè)。取培養(yǎng)至第3代生長狀態(tài)良好的hPDLCs制成單細(xì)胞懸液,以1×106·mL-1的密度接種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)85%融合時(shí),TRIzol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物2μL,用1.2%質(zhì)量瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳(100V,30min),用凝膠成像分析系統(tǒng)分析并拍照。 4.MTT法檢測(cè)hPDLCs的細(xì)胞活性：取對(duì)數(shù)生長期的第三代hPDLCs以2×103/孔的密度接種至96孔板。于各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)加入20μ1MTT液,37℃避光孵育4h；用1ml注射器吸棄原培養(yǎng)液,每孔加入150μl二甲基亞砜,振蕩溶解結(jié)晶(15min)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值(波長490nm),繪制生長曲線。 5.茜素紅染色法檢測(cè)hPDLCs礦化能力：以1×106·mL-1/孔的密度將第三代hPDLCs接種于六孔板中,待細(xì)胞長至70%時(shí),加入礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)21d,茜素紅染色,倒置顯微鏡下觀察獲取照片。 結(jié)果 1.組織塊酶消化法分離培養(yǎng)hPDLCs游出率和成活率較高。形態(tài)學(xué)觀察顯示：游出細(xì)胞多為梭形和星形,體積較大,為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。傳代細(xì)胞于24h后貼壁,貼壁后hPDLCs逐漸伸展為不規(guī)則圓形、多角形、梭形,且成放射狀增殖。 2. hPDLCs分子表型流式細(xì)胞分析顯示：CD44、CD29、CD90和CD105標(biāo)志的陽性細(xì)胞率分別為99.13、98.17、100和78.21,說明培養(yǎng)細(xì)胞為間充質(zhì)來源。 3.半定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見：Ⅰ型膠原陽性,Ⅳ型膠原陰性,此為牙周膜成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)記,證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為牙周膜成纖維細(xì)胞。 4. hPDLCs接種2天后細(xì)胞增長快速,7天的時(shí)候處于平臺(tái)期,符合成纖維細(xì)胞生長規(guī)律。 5.礦化誘導(dǎo)21d的hPDLCs,茜素紅染色后可見大小不等的紅褐色結(jié)節(jié)形成。 第二章E.coli-LPS和P.gingivalis-LPS刺激人牙周膜細(xì)胞區(qū)別表達(dá)TLR-4和TLR-2的研究 目的比較牙齦卟啉單胞菌脂多糖和大腸桿菌脂多糖誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞TLR-4和TLR-2表達(dá),明確牙齦卟啉單胞菌脂多糖作為牙周病重要影響因子的重要性,為提供更接近牙周病臨床病理模式的實(shí)驗(yàn)環(huán)境做準(zhǔn)備。 方法 1.人牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)：同第一章。 2.取第4代生長良好的hPDLCs,以1×106·mL-1接種于6孔板中,加入含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、P.gingivalis-LPS組和E.coli-LPS組。待細(xì)胞密度至85%,空白對(duì)照組不加任何刺激；P.gingivalis-LPS組加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS, E.coli-LPS組加入0.1μg·mL-1E.coli-LPS,6h后TRIzol法提取各組總RNA。將各組總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以β-actin為內(nèi)參,然后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),檢測(cè)各組細(xì)胞TLR-4和TLR-2的基因表達(dá)。 3.將生長良好的第4代hPDLCs以5×104·mL-1密度接種于每孔底部放有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,加入1ml含雙抗和胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)至貼壁并基本鋪滿蓋玻片后,棄原培養(yǎng)液,分別加入800μL含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、P.gingivalis-LPS組和E.coli-LPS組�？瞻讓�(duì)照組不加任何刺激,P.gingivalis-LPS組加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS, E.coli-LPS組加入0.1μg·mL-1E.coli-LPS。24h后收集各組細(xì)胞爬片,按步驟進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)TLR-4和TLR-2的蛋白表達(dá)。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；進(jìn)行方差分析前,先行Levene方差齊性檢驗(yàn)。對(duì)方差齊性的資料采用Bonferroni法進(jìn)行多重比較,方差不齊的資料用Dunnett's T3法進(jìn)行多重比較。 結(jié)果 1.qRT-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示：未受刺激的人牙周膜細(xì)胞中TLR-4和TLR-2弱表達(dá)。E.coli-LPS、P.gingivalis-LPS刺激6h后hPDLCs的TLR-4mRNA表達(dá)均提高(P0.001, P0.05); E.coli-LPS刺激后TLR-4基因相對(duì)表達(dá)量比P.gingivalis-LPS刺激后TLR-4的表達(dá)更為明顯(P0.01)。兩種脂多糖均能提高人牙周膜細(xì)胞TLR-2基因的表達(dá),E.coli-LPS刺激后TLR-2表達(dá)與P.gingivalis-LPS組比較無顯著差異(P=0.138)。 2.細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組TLR-4和TLR-2呈弱陽性表達(dá),E.coli-LPS、P.gingivalis-LPS刺激24h后TLR-4和TLR-2表達(dá)均明顯增強(qiáng)。E.coli-LPS組TLR-4表達(dá)明顯強(qiáng)于P.gingivalis-LPS組(P0.05),而兩組的TLR-2表達(dá)卻無明顯差別(P=0.071)。 第三章乳鐵蛋白對(duì)LPS刺激的人牙周膜細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)及炎癥因子分泌的影響 目的觀察乳鐵蛋白對(duì)經(jīng)牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激的hPDLCs表達(dá)TLR-4和TLR-2的影響,檢測(cè)乳鐵蛋白對(duì)P.gingivalis-LPS刺激的hPDLCs分泌IL-6和IL-8的影響,探索乳鐵蛋白能否調(diào)節(jié)脂多糖激發(fā)的牙周炎癥免疫過程。 方法 1.人牙周膜細(xì)胞的培養(yǎng)：同第一章。 2.取第4代生長良好的hPDLCs,以1×106·mL-1接種于6孔板中,培養(yǎng)24h至貼壁,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、LPS組、LPS+LF組�？瞻讓�(duì)照組不加任何刺激,且于0h用TRIzol法提取總RNA,-80℃凍存?zhèn)溆�；LPS組加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LP S; LPS+LF組在加入LPS前2h,分別加入5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1濃度的LF。以加入LPS開始計(jì)算時(shí)間,分別于6h及24h,用TRIzol法提取各組總RNA。以各組總RNA為模板,分別逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng),檢測(cè)各組TLR-4、TLR-2、IL-6和IL-8的基因表達(dá)。 3.取第4代hPDLCs,以1×106·mL-1接種于33mm2培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24h至貼壁,棄原培養(yǎng)液,加入含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、LPS組、LPS+LF組�？瞻讓�(duì)照組不加任何刺激,LPS組加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS; LPS+LF組在加入LPS前2h,加入10μg·mL-1LF。以加入LPS開始計(jì)算時(shí)間,24h及48h后收集各組細(xì)胞,提取總蛋白,然后進(jìn)行Western Blotting analysis檢測(cè)各組TLR-4和TLR-2的蛋白表達(dá)情況。 4.取第4代hPDLCs,以1×106·mL-1接種于6孔板中,培養(yǎng)條件同上,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、LPS組、LF+LPS組�？瞻讓�(duì)照組不加任何刺激,LPS組加入0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS; LPS+LF組在加入LPS前2h,分別加入5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1濃度的LF,以加入LPS開始計(jì)算時(shí)間,6h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照步驟進(jìn)行ELISA檢測(cè)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05；進(jìn)行方差分析前,先行Levene方差齊性檢驗(yàn)；對(duì)方差齊性的資料采用Bonferroni法進(jìn)行多重比較,方差不齊的資料用Dunnett's T3法進(jìn)行多重比較。 結(jié)果 1.0.1μg·mL-1P.gingivalis-LPS刺激6h后,hPDLCs TLR-4基因表達(dá)提高(P0.05),加入5μg·mL-1LF的hPDLCs表達(dá)TLR-4與單純LPS刺激組比較未見明顯改變,而加入10μg·mL-1、20μg·mL-1濃度LF的兩組,TLR-4表達(dá)均出現(xiàn)顯著下降(P0.01,P0.05)。 2. P.gingivalis-LPS刺激24h后,hPDLCs TLR-4基因仍保持高表達(dá),而加入5μg·mL、10μg·mL-1、20μg·mL-1LF的各組,此時(shí)TLR-4表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)(P0.05,P0.001,P0.01)。 3. P.gingivalis-LPS刺激6h后,hPDLCs TLR-2基因表達(dá)比空白組明顯提高(P0.001)；加入濃度10μg·mL-1、20μg·mL-1LF的分組TLR-2表達(dá)與單純LPS刺激組TLR-2表達(dá)比較均出現(xiàn)明顯下降(P0.001),而5μg·mL-1LF對(duì)TLR-2的表達(dá)無明顯作用(P=0.271). P.gingivalis-LPS刺激24h后,TLR-2表達(dá)比空白對(duì)照組明顯提高(P0.001),而加入5μg·mL-1,10μg·mL-1、20μg·mL-1濃度LF的各組TLR-2表達(dá)均出現(xiàn)顯著下降。 4. Western Blotting analysis結(jié)果顯示：刺激24h及48h后,LPS+LF組的TLR-4和TLR-2表達(dá)比單純LPS刺激組的表達(dá)均顯著下降。 5.LPS刺激6h后,人牙周膜細(xì)胞分泌的IL-6基因表達(dá)比空白對(duì)照組高4倍,而加入LF的各組,IL-6表達(dá)與LPS組比較均出現(xiàn)顯著下降(P0.001)；ELISA檢測(cè)顯示：加入LF后,人牙周膜細(xì)胞IL-6的分泌顯著下降(P0.05)。 6.LPS刺激的人牙周膜細(xì)胞IL-8的基因表達(dá)比空白對(duì)照組顯著上升,加入LF后,各組IL-8的分泌均出現(xiàn)不同程度的下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論 1.組織塊酶消化法培養(yǎng)hPDLCs游出時(shí)間一般為5-8d,且培養(yǎng)細(xì)胞成活率高,在多代培養(yǎng)后仍可以保持良好的細(xì)胞活性、增殖和礦化能力；結(jié)合分子表型流式細(xì)胞分析結(jié)果及半定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果,說明培養(yǎng)的hPDLCs來源可靠,細(xì)胞純度高. 2.LPS刺激后人牙周膜細(xì)胞TLR-4和TLR-2的表達(dá)增強(qiáng)；E.coli-LPS刺激后hPDLCs表達(dá)的TLR-4比P.gingivalis-LPS刺激后表達(dá)的TLR-4明顯,而兩種LPS刺激后細(xì)胞TLR-2表達(dá)無明顯差別；說明用牙周病主要致病菌牙齦卟啉單胞菌的脂多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)芴峁└咏咏R床病理模式的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。 3.LF對(duì)牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞TLR-4和TLR-2表達(dá)有下調(diào)作用；LPS刺激后人牙周膜細(xì)胞IL-6和IL-8的分泌明顯增加,LF作用后降低LPS誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞IL-6和IL-8的分泌。預(yù)示著乳鐵蛋白在調(diào)控LPS引發(fā)的牙周細(xì)胞炎癥免疫反應(yīng)方面有一定的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1664888