本文選題：牙周組織再生　切入點：牙齦卟啉單胞菌　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牙周炎是由細菌感染導(dǎo)致的牙齒支持組織的慢性炎癥性疾病。目前的治療方法主要是機械清除菌斑和局部刺激因素,以及通過牙周再生性手術(shù)如GTR促進已破壞組織的恢復(fù),但這些治療方法只能停止疾病進展,組織再生療效仍然十分有限。牙周組織工程是牙周組織再生的理想策略,其目標(biāo)是在控制局部感染的基礎(chǔ)上,使用支架材料、干細胞和細胞因子誘導(dǎo)牙周組織再生,以恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能。考慮到感染和再生兩個方面,負載抗生素/抗菌劑的組織工程支架是目前研究的焦點。傳統(tǒng)抗生素具有毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點,近來研究發(fā)現(xiàn)很多植物成分對人類病原微生物具有抗性,植物抗菌成分引起眾人的關(guān)注,逐步成為研究的熱點。黃連素(berberine,BBR)是一種芐基異喹啉生物堿,存在于白毛莨、黃連、刺檗、具芒小檗等植物的根莖中,它用于治療腹瀉已經(jīng)有兩千多年的歷史,具有療程短、療效快、副作用少、作用溫和、成本低等特點。最近研究發(fā)現(xiàn)黃連素對多種口腔致病菌具有抗菌作用。黃連浸提物以及黃連素對牙齦卟琳單胞菌(Porphyromonasgiingivalis,P.gingivlis)、伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)、中間普氏菌(Prevotella intermedia,P.intermedia)、變黑普氏菌(Preyotella nigrescens)、具核梭桿菌(Fusobacteriu.nucleatum,nucletum)等牙周致病菌具有較強的抑菌作用。將黃連藥膜置于牙周袋,可明顯減輕中重度牙周炎患者的牙齦炎癥和探診深度,提高基礎(chǔ)治療的療效。此外,Ⅱ期臨床試驗證實口服黃連上清軟膠囊可治療上焦風(fēng)熱證,中醫(yī)學(xué)中的上焦風(fēng)熱證即指急性牙周炎。黃連素在我國有著兩千多年的藥用歷史,來源豐富,獲取便利,安全經(jīng)濟,因此具有良好的臨床應(yīng)用前景。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)書籍《藥品化義》中記錄黃柏泡酒,和四物湯同服,有健骨的作用,可治療膝蓋疼痛和下肢無力。另外,用于治療骨質(zhì)疏松癥的傳統(tǒng)中草藥配方如二仙湯含有黃連素,且其中的黃連素成分是抑制骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分。動物實驗和臨床試驗表明,黃連素單獨使用或與維生素D3聯(lián)合使用能有效緩解骨質(zhì)疏松癥,減少破骨細胞的數(shù)量,抑制破骨細胞的骨吸收活性,同時促進骨形成,提高骨形成相關(guān)因子的表達水平。黃連素在一定濃度范圍內(nèi)對骨髓巨噬細胞不產(chǎn)生細胞毒性,并通過抑制NF-κB和Akt的活化抑制破骨細胞的形成和活性。以上研究中,黃連素的骨保護作用主要與抑制破骨活動相關(guān),關(guān)于黃連素促進干細胞成骨分化的研究很少。因此,本實驗中我們研究了牙周關(guān)鍵致病菌P.gingvalis及其毒力因子牙齦素RgpA感染對骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影響,評價黃連素對P.gingivalis的抑菌作用,以及對P.gingivalis感染引起的成骨分化方面效應(yīng)的調(diào)節(jié),發(fā)現(xiàn)黃連素能夠改善P.gingivalis感染引起的成骨分化能力下降,并進一步研究黃連素對BMSCs成骨分化的直接作用及可能的作用機制。將黃連素的廣譜抗菌和促進干細胞成骨分化兩方面的作用結(jié)合起來,有望用于牙周組織工程,在控制局部感染的同時,誘導(dǎo)干細胞的成骨分化潛能,提高牙周組織再生療效。第一部分黃連素改善Pgingivalis 感染引起的間充質(zhì)干細胞成骨分化能力下降[目的]細菌感染對牙周組織再生的成敗具有關(guān)鍵性的影響。P.gingivalis是慢性牙周炎的關(guān)鍵致病菌,其毒力因子牙齦素(gingipain,GP)在促進牙周組織破壞過程中發(fā)揮著重要的作用。本部分初步探索P.ginnlis及RgpA(Arginine-gingipain A)突變菌感染對間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響,同時觀察黃連素和CL(14-25)兩種抗菌藥物對P.gingivalis 感染引起效應(yīng)的改善作用。[方法1首先采用overlap PCR的方法構(gòu)建了同源重組片段up_erm_down',并將該片段連接到自殺質(zhì)粒載體上,獲得重組質(zhì)粒pPHU281_up_erm_down,將重組片段或重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入P.gingivalis ATCC33277細胞,利用細菌DNA的同源重組構(gòu)建RgpA突變菌。PCR、測序和SDS-PAGE鑒定RgpA突變菌。觀察RgpA突變菌的菌落形成和血細胞凝集活性,透射電鏡觀察RgpA突變菌的結(jié)構(gòu)組成,激光共聚焦顯微鏡觀察RgpA突變菌的生物膜形成。CCK-8檢測P.gingivalis和RgpA突變菌感染對間充質(zhì)干細胞增殖活性的影響。qPCR檢測間充質(zhì)干細胞成骨分化相關(guān)基因的表達。微量肉湯稀釋法檢測黃連素和CL(14-25)對P.gingivalis的抑菌作用。提取并純化細菌培養(yǎng)上清中的牙齦素蛋白,根據(jù)酶促反應(yīng)的熒光產(chǎn)物釋放量,檢測黃連素和CL(14-25)對RgpA酶活性的抑制作用。[結(jié)果]成功構(gòu)建了P.gingivalis ATCC33277 RgpA突變菌,與野生型菌相比,RgpA突變菌血細胞凝集活性下降、菌體胞外囊泡減少、細菌生物膜形成增加。感染復(fù)數(shù)MOI為100:1時,P.gingivaais及RgpA突變菌感染BMSCs 24h對細胞的增殖活性無明顯影響,但引起Runx2、ALP、OCN等成骨分化相關(guān)基因的表達下降,P.gingivalis及RgpA突變菌感染對BMSCs成骨分化的影響無顯著差異。黃連素和CL(14-25)兩者均可抑制P.gingivalis 細菌的生長,且抑菌作用呈現(xiàn)藥物濃度依賴性,其中黃連素最小抑菌濃度是31.3 μg/mL。黃連素和CL(14-25)均可抑制RgpA的酶活性,且酶活性抑制作用呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。黃連素顯著改善P.gingvalis感染引起的間充質(zhì)干細胞成骨分化基因下調(diào),且與未感染對照組相比,進一步上調(diào)了 OSX、COLI、ALP、OCN、OPN等基因的表達。[結(jié)論]成功構(gòu)建了RgpA 突變菌;在不影響細胞增殖活性的情況下,P.gingivalis感染引起B(yǎng)MSCs成骨分化基因表達下降,P.gingivalis毒力因子RgpA在此過程中作用不大;黃連素對P.gingivalis的抑菌作用顯著優(yōu)于CL(14-25);黃連素能夠改善P.gingivalis感染引起的間充質(zhì)干細胞成骨分化能力下降。第二部分黃連素對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化能力的影響[目的]第一部分實驗發(fā)現(xiàn)黃連素能夠改善P.gingivalis 感染引起的干細胞成骨分化基因表達下降,本部分實驗?zāi)康氖茄芯奎S連素對BMSCs成骨分化的直接作用。[方法]首先采用全骨髓貼壁法,分離大鼠BMSCs,做原代培養(yǎng)。觀察細胞形態(tài)特征及生長情況,測定生長曲線,流式細胞儀檢測CD90、CD105、CD45、CD11b等細胞表面標(biāo)記。成骨誘導(dǎo)21天,茜素紅染色檢測成骨礦化能力;成脂誘導(dǎo)18天,油紅O染色檢測成脂分化能力。采用CCK-8法檢測黃連素對大鼠BMSCs增殖活性的影響。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入0、1、3、10、30 μM黃連素,培養(yǎng)BMSCs 3天和7天后,堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)活性檢測試劑盒和染色分析觀察ALP的表達;培養(yǎng)7、14天后,qPCR分別檢測成骨分化相關(guān)因子(Runx2、OSX、COLI、ALP、OCN、OPN)的 mRNA表達水平;培養(yǎng)18天后,茜素紅染色分析細胞礦化。[結(jié)果]分離獲得的細胞具有貼壁特性;細胞表面CD90、CD105呈陽性表達,陽性率分別為99.5%、99.8%;CD45、CDllb表達陰性,表達率分別為4.67%、3.72%;具有多向分化潛能,在特定條件下可分化成成骨細胞和脂肪細胞。在2-32 μM濃度范圍內(nèi)黃連素對大鼠BMSCs沒有細胞毒性。與對照組相比,黃連素濃度在1-10 μM時顯著促進細胞ALP的活性,1、3μM時上調(diào)OSX、COLI、ALP、OCN、OPN等成骨相關(guān)基因的mRNA表達水平,促進礦化形成。黃連素促間充質(zhì)干細胞成骨分化的最適濃度為3 μM。[結(jié)論]采用全骨髓貼壁法成功分離獲得大鼠原代BMSCs。3μM黃連素顯著促進BMSCs的成骨分化能力,同時不影響細胞的增殖活性。第三部分黃連素通過Wnt/p-catenin信號通路促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[目的]進一步研究黃連素促進BMSCs成骨分化的作用機制。Wnt/β-catenin信號通路在骨生物學(xué)中發(fā)揮重要作用,Runx2、OSX、OCN、OPN是該通路的下游靶基因,第二部分實驗證實,黃連素上調(diào)BMSCs成骨相關(guān)基因Runx2、OSX、OCN、OPN等的表達,黃連素可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化。本部分探討Wnt/β-catenin信號通路是否參與黃連素促進BMSCs成骨分化的過程。[方法]將0、1、3、10、30 μM的黃連素加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,培養(yǎng)1、3、7天,提取BMSCs的的總蛋白、細胞漿蛋白、細胞核蛋白,Western Blot檢測β-catenin的蛋白表達。SABC-CY3免疫組化進行免疫熒光染色,觀察β-catenin蛋白的亞細胞定位。雙熒光素酶報告基因檢測β-catenin與TCF/LEF(T-cell factor/Lymphoid enhancer factor)轉(zhuǎn)錄因子的作用活性。Wnt信號通路特異性抑制劑DKK-1預(yù)處理間充質(zhì)干細胞,觀察在阻斷Wnt/β-catenin信號通路的情況下,黃連素對干細胞成骨分化的影響。[結(jié)果]黃連素處理細胞3天,與對照組相比,各加藥組總蛋白提取物中β-catenin蛋白水平顯著升高(P0.05),3、10μM藥物組胞漿蛋白水平顯著升高(P0.05),各組胞核β-catenin蛋白積累均顯著高于對照(P0.05),且最高相比對照組增加了 3倍左右。3 μM黃連素孵育細胞72 h,細胞免疫熒光的結(jié)果示胞內(nèi)β-catenin蛋白積累增加,并且向細胞核移位;3μ ^黃連素孵育細胞24 h,TOP flash/Fop flash雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果示,β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性升高,升高至對照組的2倍左右。Wnt特異性抑制劑DKK-1預(yù)先加入細胞孵育24 h以阻斷Wnt信號,然后加入3 μM黃連素,加藥3天后DKK-1+ BBR組的β-catenin蛋白表達和ALP活性與BBR組相比顯著降低(P0.05);加藥7天后DKK-1+ BBR組的ALP、COLI、OCN mRNA表達與未做任何處理的對照組相比有所上調(diào),但明顯低于BBR組CP0.05);此外,DKK-1+BBR組的細胞鈣結(jié)節(jié)形成與BBR組相比明顯減少。[結(jié)論]Wnt/β-catenin信號通路參與黃連素促進間充質(zhì)干細胞成骨分化的過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

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本文編號：1615337