本文選題：細(xì)胞凋亡　切入點：牙周膜細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的： 細(xì)胞的凋亡可以由多種因素誘導(dǎo)，而氧自由基對細(xì)胞的攻擊是其中重要的一種，過氧化氫是一種強氧化劑，他能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，而ROS會主動攻擊DNA雙鏈，導(dǎo)致其發(fā)生畸變。過氧化氫(H2O2)是口腔臨床治療中的常用藥物，常用于牙齒漂白，牙周沖洗，直接作用于牙齦、牙周組織。但實際上它也是把雙刃劍，除了有治療作用以外，它還可能誘發(fā)組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，過氧化氫作為關(guān)鍵的氧化代謝產(chǎn)物，在由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的疾病中起著重要的作用。幾乎所有的氧化應(yīng)激反應(yīng)都產(chǎn)生過氧化氫，其中也包括牙周炎，而牙周炎是導(dǎo)致牙齒松動和脫落最主要的原因之一。越來越多的證據(jù)表明過氧化氫能調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，能夠引起細(xì)胞凋亡和壞死。過氧化氫能夠穿透細(xì)胞膜，通過影響細(xì)胞內(nèi)的敏感因子，起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的第二信使作用。研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式與細(xì)胞的類型、過氧化氫的濃度及剌激的方式有關(guān)。XIAP蛋白是新發(fā)現(xiàn)的抗凋亡蛋白家族中最強的凋亡抑制因子，它可直接抑制caspases，顯示出強效保護細(xì)胞免受各種凋亡刺激的作用，并可多途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。 目前，關(guān)于口腔治療中使用過氧化氫氧及氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過氧化氫對牙周膜潛在毒性的研究尚少，有關(guān)過氧化氫誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡的機制幾乎很少有相關(guān)報道。此外，作為重要的凋亡抑制因子，XIAP蛋白在氧化損傷所致人牙周膜細(xì)胞凋亡的信號通路中是否起到關(guān)鍵的調(diào)控作用，目前尚未可知。因此，對過氧化氫所激發(fā)的牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDL）凋亡的分子機理進行研究，將會為牙周炎癥的預(yù)防和治療及牙周組織的修復(fù)重建提供重要理論依據(jù)。 研究內(nèi)容： 本研究主要包括三個實驗，實驗一：觀察牙周膜細(xì)胞在過氧化氫刺激下的生物學(xué)反應(yīng)，主要包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率。實驗二：過表達(dá)和基因沉默XIAP蛋白后，牙周膜細(xì)胞的活性變化。實驗三：研究XIAP蛋白在抗凋亡激酶信號通路中的調(diào)控機制。 研究方法： 利用HE染色以及波形蛋白染色技術(shù)鑒定并建立人牙周膜細(xì)胞系，首先分別通過MTT對細(xì)胞存活性的檢測，以及流式細(xì)胞儀對細(xì)胞周期的分析，TUNEL法以及流式細(xì)胞儀PI-FITC雙染色法并配合光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、對細(xì)胞凋亡的檢測并建立過氧化氫誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡模型，然后通過Western blotting以及免疫熒光在激光共聚焦顯微鏡的配合下判定在該模型中XIAP蛋白的表達(dá)情況，利用分子克隆技術(shù)分別過表達(dá)或者基因沉默XIAP的手段研究XIAP在此凋亡模型中的作用，同時檢測不同信號通路AKT、JNK2、以及GSK3β分子通路與XIAP在此凋亡模型中的相互關(guān)系，最后在過表達(dá)或者基因沉默XIAP蛋白的情況下，分別使用過氧化氫再次處理細(xì)胞，并使用western blotting以及酶聯(lián)免疫技術(shù)對此過程中細(xì)胞內(nèi)分子機制進行探討，分別檢測Casepase-3，Casepase-8，PTEN蛋白。 結(jié)果 1.分別使用梯度濃度的過氧化氫作用牙周膜細(xì)胞后，MTT檢測結(jié)果顯示，處理細(xì)胞24h，當(dāng)過氧化氫濃度高于125μM時，細(xì)胞存活率顯著下降，通過TUNEL法以及流式細(xì)胞儀檢測到250μM過氧化氫作用72h后能夠檢測到36.5%的細(xì)胞凋亡率，確定過氧化氫誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞凋亡模型建立成功。 2.72h250μM的過氧化氫作用下，Western blotting結(jié)果顯示XIAP蛋白水平下降（p0.05），同時檢測到JNK2、AKT、PAKT,以及GSK3β蛋白水平同對照組相比也有顯著性下降，激光共聚焦結(jié)果也顯示AKT、PAKT蛋白水平明顯下降。使用250μM過氧化氫處理細(xì)胞，隨著作用時間的增加，24h、48h、72h后western blotting檢測到細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-8、PTEN蛋白的含量隨之升高，與對照組相比具有顯著性（p0.05）。 3.當(dāng)對細(xì)胞進行過表達(dá)XIAP后，細(xì)胞內(nèi)JNK2、AKT、PAKT,以及GSK3β蛋白的表達(dá)沒有明顯變化，72h250μM的過氧化氫同時作用過表達(dá)XIAP與正常細(xì)胞，過表達(dá)XIAP細(xì)胞內(nèi)JNK2、AKT、PAKT,以及GSK3β蛋白水平比正常細(xì)胞高（p0.01），且具有顯著性意義，同時，過表達(dá)組過氧化氫處理后，MTT以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測到細(xì)胞存活率顯著上升，激光共聚光顯微鏡顯示，過表達(dá)XIAP后，72h250μM過氧化氫處理后，c-jun以及AP-1蛋白的表達(dá)顯著上升。 4.在基因沉默的作用下，MTT檢測到細(xì)胞存活率與對照組相比顯著下降，JNK2, AKT, PAKT,以及GSK3β蛋白表達(dá)水平與對照組相比也顯著下降。 結(jié)論 1．過氧化氫（H2O2）對牙周膜細(xì)胞生長的抑制隨著濃度的升高及作用時間的延長而增強 2．H2O2誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞凋亡最佳的模型為：H2O2的濃度250μM，作用細(xì)胞的時間為72h。 3．H2O2通過誘導(dǎo)XIAP蛋白表達(dá)水平的下降，抑制XIAP蛋白與凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的結(jié)合，致使牙周膜細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而XIAP蛋白的表達(dá)對細(xì)胞的活性有顯著的影響。 4．AKT、JNK2、GSK3β蛋白在H2O2誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞凋亡的機制中起著重要作用，XIAP蛋白可能是通過調(diào)節(jié)這三條信號通路，使這三種蛋白表達(dá)水平保持在正常水平從而實現(xiàn)抗凋亡效應(yīng)。 5．XIAP蛋白激活C-jun和AP-1這兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，，其可能的機制為XIAP蛋白正向調(diào)節(jié)JNK2，通過磷酸化C-jun而實現(xiàn)。 6．XIAP蛋白對AKT的修復(fù)作用可能通過抑制PTEN的表達(dá)來實現(xiàn)。
[Abstract]:Research background and purpose:
Apoptosis can be induced by a variety of factors, and the attack of oxygen radicals on the cell is an important one among them, hydrogen peroxide is a strong oxidizer, he could induce cells to produce large amounts of reactive oxygen species (ROS), and ROS will take the initiative to attack DNA double chain, leads to the distortion of hydrogen peroxide (H2O2.) is commonly used in clinical medicine for treating oral cavity, commonly used in tooth bleaching teeth, Zhou Chongxi, direct effect on the gums, periodontal tissue. But in fact it is a double-edged sword, in addition to have therapeutic effects, it may also induce tissue oxidative stress, leading to cell death. In addition, H2O2 as oxidation products of key which plays an important role in the oxidative stress mediated diseases. Oxidative stress almost all produce hydrogen peroxide, including periodontitis and periodontitis is lead to loose teeth fall off and one of the main reasons. More and more evidence indicates that hydrogen peroxide can regulate cell function, can induce cell apoptosis and necrosis. Hydrogen peroxide can penetrate the cell membrane, the sensitive factors affecting cells, play a role of the second messenger in signal transduction pathways. The study found that the type of hydrogen peroxide induced cell death and cell, the concentration of hydrogen peroxide and stimulation. The way the.XIAP protein is the strongest apoptosis newly discovered anti apoptosis protein family inhibition factor, it can directly inhibit caspases, showed potent protection of cells from various apoptotic stimuli, and multiple pathways that regulate cell apoptosis.
鐩墠,鍏充簬鍙ｈ厰娌葷枟涓嬌鐢ㄨ繃姘у寲姘㈡哀鍙婃哀鍖栧簲嬋

本文編號：1611159