本文選題：金納米棒　切入點(diǎn)：口腔癌　出處：《武漢大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率占全身腫瘤的第六位,每年累及超過300,000人,五年生存率不超過50%。在美國,每年有超過35,000人被新診斷為口腔癌,在2008年就曾報道接近8,000人死于口腔癌。其惡性程度高,預(yù)后差,發(fā)病機(jī)制尚不清楚�？谇话┰谠缙诙鄡H表現(xiàn)為黏膜改變,例如潰瘍,白斑,紅斑等,病變面積小與其他黏膜疾病難以區(qū)分,而當(dāng)癥狀真正引起病人注意時往往為時已晚。因此,延遲的診斷和治療是口腔癌的診斷率和存活率不能提高的主要原因。約60%的口腔癌被發(fā)現(xiàn)時已是晚期,約90%的口腔癌為鱗狀上皮細(xì)胞癌,且近年來有年輕化的趨勢。另一方面,相對于肝癌、肺癌等深部腫瘤,口腔癌位置表淺,因此及時發(fā)現(xiàn)和治療的可行性高。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療癌前病變是目前降低口腔鱗癌病死率的惟一途徑。 對此,本課題組致力于發(fā)現(xiàn)新的癌癥篩查方式,改善其生活質(zhì)量及生存率。杜格非曾研究了孟加拉紅(Rose bengal, RB)染色對于口腔癌的篩查效果,通過病損部位涂布孟加拉紅,其診斷敏感性和特異性可達(dá)93.9%和73.7%,但RB對部分炎癥染色與癌癥染色難于區(qū)分。我組合作成員王佳宏等人通過螯合RB與納米金棒合成新材料,利用敏感的光學(xué)檢測提出新的口腔癌診斷思路,通過納米金棒的紅移現(xiàn)象,暗場成像等高新技術(shù)實(shí)現(xiàn)口腔癌細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞的甄別,但僅為實(shí)驗(yàn)室研究,同時臨床運(yùn)用需要多種精密光學(xué)儀器,費(fèi)用昂貴。在此基礎(chǔ)上,本課題結(jié)合前人篩查方法臨床要求的快捷簡便及光學(xué)診斷的靈敏等優(yōu)勢,旨在建立診斷效率更高且更具有臨床運(yùn)用價值的口腔癌早期篩查系統(tǒng)早期檢測口腔癌,并通過探究口腔黏膜惡性改變機(jī)制,希望在減緩或遏制其惡性化轉(zhuǎn)變的同時,為以后尋找合適的口腔癌診斷的靶向分子打好基礎(chǔ),最終能通過靶向分子的特異性診斷提高診斷效率,進(jìn)一步提高口腔癌生存率。 活檢是癌癥臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn),通過切取病變組織后由病理學(xué)家觀察微觀細(xì)胞形態(tài)改變得出診斷,因此需要經(jīng)驗(yàn)豐富的病理專家,主觀性強(qiáng)。此外活檢具有一定的侵入性,然而只有2%左右的黏膜改變可能轉(zhuǎn)化為癌癥,反復(fù)操作易對患者造成較大損傷,所以為了減少患者不必要的痛苦,我們希望能利用表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)實(shí)現(xiàn)少量組織或細(xì)胞拉曼信號收集,完成活檢前的篩查工作。而早期研究中,拉曼己經(jīng)被成功用于腎癌,肝癌,肺癌,宮頸癌等各種癌癥的診斷。研究結(jié)果顯示對活檢切除的組織進(jìn)行拉曼檢測,分析光譜數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)拉曼可很好的區(qū)分正常,炎癥,癌前及癌癥組織。但是生物樣本的拉曼信號通常較弱,需要大塊的活檢組織,而相對于活檢來說拉曼檢測仍然是不必要的,因此拉曼檢測在臨床的運(yùn)用受到一定的限制。隨著科學(xué)研究發(fā)展,SERS利用納米金屬顆粒的SPR效應(yīng)放大拉曼信號,僅僅需要收集少量細(xì)胞即可完成高敏篩查,再次使拉曼成為研究熱點(diǎn)。 早在單分子檢測應(yīng)用中,SERS技術(shù)即可達(dá)到超高的分辨率,可完成超低濃度溶液或者超薄薄膜中分子的檢測。有研究人員報道能夠達(dá)到非�？捎^的,即1014～1015的增強(qiáng)效果。因此近幾年,SERS技術(shù)引起了各領(lǐng)域相關(guān)科研人員的極大興趣。在生物化學(xué)領(lǐng)域,SERS光譜能夠反映蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象等信息,有助于揭示生命的奧秘。在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,SERS技術(shù)最大的特點(diǎn)就是無損,因此在水溶液樣品的分析和選擇性激發(fā)等方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。Sequaris等首次報道了用SERS技術(shù)表征鉑的配合物與DNA的相互作用,此后很多科研小組都表示出濃厚的興趣,相繼開始了這方面的研究。研究者發(fā)現(xiàn)SERS可成功實(shí)現(xiàn)靈敏的檢測出基因變異,超敏檢測蛋白及RNA等。同時通過特異性分子標(biāo)記后,靶向檢測特定蛋白,DNA, RNA等也已成功實(shí)現(xiàn),但是臨床實(shí)踐還有待進(jìn)一步研究。同時有學(xué)者通過SERS探針實(shí)現(xiàn)了動物活體及活細(xì)胞的生物成像,完成生物過程的可視化。 因此本實(shí)驗(yàn)第一個部分利用表面等離子納米貴金屬材料SERS效應(yīng)來完成口腔癌的篩查�？谇话┎∽兌啾憩F(xiàn)為黏膜改變,與其他黏膜疾病難于區(qū)分,同時容易被忽略,另一方面口腔癌位置表淺,通過脫落細(xì)胞技術(shù)可以方便收集少量的細(xì)胞樣品,然后利用SERS的放大效應(yīng)及拉曼檢查的快速無損性等特點(diǎn),發(fā)明一種新的簡便的具有臨床意義的癌癥篩查系統(tǒng)。 本實(shí)驗(yàn)第二個部分用于探究自噬在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的早期變化。自噬是一種生物長期進(jìn)化保留下來的生物過程,用于長壽命蛋白質(zhì)及溶酶體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器成分的降解與循環(huán)再利用,是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象�，F(xiàn)已有大量研究表明自噬在多種癌癥發(fā)生發(fā)展中,例如肝癌,皮膚癌,胃癌等,中起到了重要作用。然而,其結(jié)果具有一定的矛盾性。在不同的刺激因素下,例如活性氧刺激自噬產(chǎn)生,抑制細(xì)胞增殖進(jìn)而抑制腫瘤生長。Beclin1,是自噬前體形成的重要蛋白,能與Vps34,Vps15互相結(jié)合形成自噬前體。而抑制Beclin1蛋白可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。同時自噬是區(qū)別于凋亡,壞死等的一種程序性死亡過程,因而可以認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞死亡的過程。然而,在某些情況下自噬能促進(jìn)腫瘤發(fā)展。一旦腫瘤形成,自噬可作為一種自我保護(hù)機(jī)制,為腫瘤生長提供能量,并抵抗放化療療效。因此,我們推斷,自噬對于腫瘤的功能影響可能是源于不同的條件。腫瘤種類不同及階段不同,自噬所起的作用都不盡相同。自噬相關(guān)蛋白在癌癥中可表現(xiàn)為低表達(dá)或過度表達(dá),其介導(dǎo)的損傷緩解抑制腫瘤在癌前狀態(tài),同時在特定的狀態(tài)下促進(jìn)腫瘤存活,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腫瘤預(yù)后及分期可能具有相關(guān)性。而口腔癌相關(guān)研究結(jié)果顯示約2-12%的口腔癌癌前病變(oral premalignant lesions, OPLs)發(fā)展為癌變,80%的口腔癌源于OPLs,但是有90%左右的OPLs不會惡變?yōu)榘┌Y,長期表現(xiàn)為紅白斑及口腔扁平苔蘚,因此對口腔癌前病變惡性轉(zhuǎn)化可能性的判斷,可有效減輕患者心理壓力,改善生活質(zhì)量,但是自噬相關(guān)水平與口腔癌惡性程度轉(zhuǎn)化可能性是否相關(guān)? 目前己知自噬對癌癥病人分層意義重大,但對口腔癌自噬的研究較為稀缺,無法確定自噬在口腔癌中的表達(dá)高低與口腔癌預(yù)后等的關(guān)系等。所以,我們通過一個口腔癌發(fā)生發(fā)展模型來調(diào)查自噬的變化,并了解其在口腔癌早期惡性病變過程中的作用機(jī)制作為前期研究。后期仍需要更大量的實(shí)驗(yàn)來完成自噬特異性分子的篩選,從而實(shí)現(xiàn)靶向SERS的口腔癌篩查。 實(shí)驗(yàn)第一部分利用等離子納米顆粒,實(shí)現(xiàn)無適配子的SERS口腔癌篩查,在小樣本研究中對正常脫落細(xì)胞和癌癥脫落細(xì)胞的區(qū)分顯示較好靈敏度和特異性,但是針對癌癥與炎癥,癌前病變的甄別,針對惡性轉(zhuǎn)變幾率小和惡性轉(zhuǎn)變可能性大黏膜病損的甄別等更具有臨床意義,其重復(fù)性仍需要進(jìn)一步檢驗(yàn)。而自噬檢測在病人分層中具有重大意義,與癌癥預(yù)后復(fù)發(fā)率等關(guān)系莫大,可能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)。而口腔癌自噬相關(guān)研究較少。因此,我們希望能夠通過對口腔癌機(jī)制初探,為后期合適的癌癥篩查標(biāo)記篩選打好基礎(chǔ)。最后,仍然需要大量的工作實(shí)行通過標(biāo)記物與SERS的結(jié)合,利用SERS量化測量自噬水平,達(dá)到更好的篩查效果。 第一部分：一種基于SERS的非侵襲性等離子癌癥篩查方法 背景：SERS可以實(shí)現(xiàn)單分子水平的測量,因此可被運(yùn)用于癌癥篩查。目的：利用SERS完成癌癥篩查,檢測該篩查方法的診斷靈敏度。方法：利用納米貴金屬顆粒表面等離子共振效應(yīng)形成SERS,通過細(xì)胞脫落技術(shù)采集少量病變細(xì)胞,然后制作表面等離子基底,并利用SERS效應(yīng)放大細(xì)胞信號,然后通過信號分析來篩查癌癥。而拉曼散射增強(qiáng)基底的制作是通過浸泡的方式及靜電結(jié)合原理,將納米金棒吸附到濾紙上面,形成可彎曲的三維的異質(zhì)性拉曼基底。結(jié)果：正常細(xì)胞與癌癥細(xì)胞SERS光譜存在差異,揭示了癌癥特定生物分子的變化,包括癌細(xì)胞增加的核酸和蛋白質(zhì)以及減少的脂質(zhì)。為了區(qū)分20例正常脫落細(xì)胞和癌脫落細(xì)胞,峰值比算法I16001440, I14401340(1600和1440cm-1峰位峰值比,1440和1340cm-1峰位的峰值比)診斷靈敏度和特異性可達(dá)100%,而I14401340(1440和1340cm-1峰位峰值比)僅達(dá)到70%的靈敏度和60%的特異性。 結(jié)論：此方法操作簡便,迅速,經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,安全性高,診斷效率高,且具有非侵襲性,具有一定的臨床運(yùn)用前景。同時此方法可以通過計算機(jī)分析進(jìn)行自動化診斷,運(yùn)用范圍廣泛,可能運(yùn)用于全身各表皮癌癥的篩查,因此可成為臨床上癌癥篩查及診斷很好的輔助手段。 第二部分：自噬與口腔癌發(fā)生的關(guān)系 目的：觀察自噬在口腔癌發(fā)生發(fā)展中的變化,研究其在口腔上皮惡性改變發(fā)生發(fā)展中可能的作用及調(diào)控機(jī)制。方法：建立從健康上皮到口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展模型,在倉鼠左側(cè)頰囊涂布0.5%DMBA,分別在4周,8周,10周,13周時處死。通過免疫組化,免疫熒光及western blot的方法來觀察LC3,Beclin1,Bcl-2三個指標(biāo)的表達(dá)。通過8-oHdG免疫組化結(jié)果來評估DNA損傷。結(jié)果：LC-3與Beclin1在4周時表達(dá)增加明顯(p0.05),但是在8周,10周,13周開始逐步減少。而Bcl-2表達(dá)持續(xù)增加,在13周時表達(dá)最多。而免疫熒光顯示Bcl-2與Beclin1的共定位在4周迅速達(dá)到高峰,而后逐步減少。同時8-OhdG在4周時表達(dá)增加較少,而在8周,10周,12周迅速增加。結(jié)論：自噬在癌癥發(fā)生發(fā)展中可能通過消除DNA損傷的方式來抑制癌癥發(fā)展,但是隨著刺激的持續(xù)增加,自噬清除DNA損傷的能力逐步下降,而自噬的耗竭可能加速上皮的惡變,因此可以通過對自噬的量化判斷其惡性轉(zhuǎn)化可能性。而自噬可能的調(diào)控機(jī)制可能受Beclin1與Bcl-2的共定位調(diào)節(jié)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.85

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉全;王建軍;潘永成;孟利峰;詹曦;鄭慶豐;;自噬相關(guān)基因Beclin1和MAPLC3在肺癌組織中的表達(dá)及其意義[J];癌癥;2008年01期

2 沈揚(yáng);梁立治;洪明晃;熊櫻;魏梅;朱孝峰;;微管相關(guān)蛋白LC3和自噬基因Beclin1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其意義[J];癌癥;2008年06期

3 王贊宏;彭芝蘭;段振玲;劉輝;;自噬基因Beclin 1在宮頸鱗癌中的蛋白表達(dá)及其臨床意義[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2006年06期

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本文編號：1577781