本文關(guān)鍵詞： Ta 人單核細(xì)胞 體外細(xì)胞毒性 細(xì)胞凋亡 IL-6 TNF-α　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 口腔種植是目前修復(fù)牙列缺損、缺失最有效的手段之一,已經(jīng)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。自從1969年Branemark首次將鈦種植體成功植入頜骨內(nèi),鈦金屬材料逐漸成為口腔種植修復(fù)的主流材料,其特點(diǎn)包括輕質(zhì)、強(qiáng)度高以及良好的抗疲勞性能。在我國(guó),種植牙也得到了越來(lái)越廣泛的開(kāi)展,大部分種植牙獲得了良好的功能和美觀效果。但是,同時(shí)也有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,56%的患者和43%的種植體有著不同程度的骨喪失,這意味著種植體存在失敗的風(fēng)險(xiǎn)。其中最常見(jiàn)的失敗原因在于感染及種植體的表面處理因素。近年來(lái)的研究表明,種植體周?chē)资菍?dǎo)致種植修復(fù)失敗的重要原因之一。分泌炎癥因子的細(xì)胞種類(lèi)很多,如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,而其中單核細(xì)胞是炎癥因子最重要的來(lái)源。而在炎癥因子中,主要有IL-6以及TNF-a等參與炎癥過(guò)程,與種植體骨界面的骨吸收密切相關(guān)。 另一方面,種植失敗來(lái)源于牙膏、漱口液以及飲用水中的氟離子以及體液的腐蝕作用。鈦和鈦合金種植體表面存在一層鈍化膜(Ti02),其在含氟環(huán)境下的抗腐蝕能力不足。因此在口腔環(huán)境中氟離子可導(dǎo)致該鈍化膜的破壞,破壞種植體與骨組織的結(jié)合。因此,提高牙種植體的抗腐蝕性能和生物學(xué)性能十分重要。深化鈦種植體的表面改性研究,使其具備更好的表面及整體性能,能有效縮短臨床愈合時(shí)間,以達(dá)到早期生物穩(wěn)定并維持功能負(fù)重后的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的良好效果。鉭金屬(Ta)材料作為種植體涂層,可增強(qiáng)材料的抗腐蝕性能及耐磨損性能。而Ta具有良好的骨附著性,在骨科領(lǐng)域也有較多的應(yīng)用。 研究目的 本研究的目的是對(duì)Ta顆粒的生物安全性作初步評(píng)價(jià),并進(jìn)一步探討Ta顆粒對(duì)人單核細(xì)胞毒性及分泌炎癥細(xì)胞因子的影響,從而了解Ta材料作為種植體涂層的應(yīng)用前景。 材料和方法 第一部分 本研究通過(guò)Ta顆粒與人單核細(xì)胞(THP-1)共培養(yǎng),檢測(cè)該材料的生物安全性及其對(duì)人單核細(xì)胞細(xì)胞因子IL-6、TNF-a分泌的影響。 檢測(cè)Ta顆粒對(duì)THP-1的體外細(xì)胞毒性(參照ISO10993-5：2009進(jìn)行試驗(yàn))： 采用THP-1細(xì)胞系,使用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基,在37℃、5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,制備細(xì)胞懸液。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法,控制細(xì)胞密度在1×104/ml,將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中(100μL/孔)。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后,按照實(shí)驗(yàn)分組方法分別將相應(yīng)實(shí)驗(yàn)材料加入到各組細(xì)胞懸液中。實(shí)驗(yàn)分組如下： 空白組：不含細(xì)胞和樣品的培養(yǎng)液,僅用于計(jì)算細(xì)胞存活率； 陰性對(duì)照組：含有THP-1細(xì)胞及培養(yǎng)液,不含樣品； 陽(yáng)性對(duì)照組：含有THP-1細(xì)胞及0.64%苯酚的低糖DMEM培養(yǎng)液(單獨(dú)設(shè)置培養(yǎng)板,防止苯酚揮發(fā)影響實(shí)驗(yàn)組)； HA顆粒組：含有THP-1細(xì)胞、培養(yǎng)液及HA顆粒(SAR=10：1)； Ta顆粒組：含有THP-1細(xì)胞、培養(yǎng)液及Ta顆粒(SAR=10：1)。 按照3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)每組設(shè)置3塊平行板,每組樣本量為15。在以上三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體外細(xì)胞毒性檢測(cè)。向各組樣本中加入CCK-8試劑(10μL/孔),將96孔培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h,使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的OD值。 第二部分 檢測(cè)Ta顆粒對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響： THP-1細(xì)胞培養(yǎng)同第一部分。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h后,按照實(shí)驗(yàn)分組方法分別往陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液中加入相應(yīng)實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)分組如下： 陰性對(duì)照組：含有THP-1細(xì)胞及培養(yǎng)液,不含樣品； 陽(yáng)性對(duì)照組：含有THP-1細(xì)胞及脂多糖(LPS)(選取濃度為500ng/m1)的低糖DMEM培養(yǎng)液(單獨(dú)設(shè)置培養(yǎng)板,防止影響實(shí)驗(yàn)組)； HA顆粒組：含有THP-1細(xì)胞、培養(yǎng)液及HA顆粒(SAR=10：1)； Ta顆粒組：含有THP-1細(xì)胞、培養(yǎng)液及Ta顆粒(SAR=10：1)。 按照3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24h、48h、72h)每組設(shè)置3塊平行板,樣本量為15。實(shí)驗(yàn)材料與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后,顯微鏡下觀察THP-1細(xì)胞形態(tài)并拍照。離心(2000rpm,5mmin)收集細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞二次,收集1-5x105細(xì)胞。加入500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞后,分別加入5μlAnnexin V-FITC及PI混勻,室溫避光反應(yīng)10min。1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡情況。 第三部分 檢測(cè)Ta顆粒對(duì)THP-1分泌炎癥因子的影響： THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)干預(yù)同第一部分。實(shí)驗(yàn)分組如下： 陰性對(duì)照組：具有培養(yǎng)基、THP-1細(xì)胞； 陽(yáng)性對(duì)照組：含有THP-1細(xì)胞及LPS(選取濃度為300ng/m1)的低糖DMEM培養(yǎng)液(單獨(dú)培養(yǎng),防止影響實(shí)驗(yàn)組)； HA顆粒組：具有培養(yǎng)基、THP-1細(xì)胞和HA顆粒(SAR=10：1)； Ta顆粒組：具有培養(yǎng)基、THP-1細(xì)胞和Ta顆粒(SAR=10：1)。 樣本量為15,實(shí)驗(yàn)材料與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間選擇24h、48h和72h。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組細(xì)胞IL-6、TNF-a的表達(dá)水平。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS13.0軟件,通過(guò)析因方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)24h后檢測(cè)各組OD值分別為：陰性對(duì)照組為1.086±0.095；陽(yáng)性對(duì)照組為0.342±0.033；Ta顆粒組為1.041±±0.090；HA顆粒組為1.053±±0.088。陰性對(duì)照組與Ta顆粒組、HA顆粒組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組、Ta顆粒組、HA顆粒組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)48h后檢測(cè)各組OD值分別為：陰性對(duì)照組為1.198±±0.118；陽(yáng)性對(duì)照組為0.328±±0.034;Ta顆粒組為1.132±±0.122；HA顆粒組為1.129±0.113。陰性對(duì)照組與Ta顆粒組、HA顆粒組問(wèn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組、Ta顆粒組、HA顆粒組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)72h后檢測(cè)各組OD值分別為：陰性對(duì)照組為1.393±±0.078；陽(yáng)性對(duì)照組為0.322±±0.019；Ta顆粒組為1.312±±0.070；HA顆粒組為1.309±±0.068。陰性對(duì)照組與Ta顆粒組、HA顆粒組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組、Ta顆粒組、HA顆粒組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,同種處理方法隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組的OD值呈增加趨勢(shì),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。體外細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果表明Ta顆粒與THP-1共同培養(yǎng),24h、48h及72h均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性(P0.05)。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)散點(diǎn)圖結(jié)果顯示,各組壞死細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占比例極小。而陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞。陰性對(duì)照組、HA顆粒組以及Ta顆粒組以正�；罴�(xì)胞為主,同時(shí)可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。Annexin V-FITC/PI染色顯示：陰性對(duì)照組24h、48h及72h總的細(xì)胞凋亡率分別為8.7±0.8%、9.1±0.9%及15.0±0.8%；陽(yáng)性對(duì)照組24h、48h及72h總的細(xì)胞凋亡率分別為48.4±3.8%、48.9±4.8%及49.2±3.0%；Ta顆粒組24h、48h及72h總的細(xì)胞凋亡率分別為10.0±0.9%、10.6±1.1%及22.1±1.2%；HA顆粒組24h、48h及72h總的細(xì)胞凋亡率分別為9.7±0.9%、10.1±0.8%及21.3±1.0%。各組細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率雖然隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而有所增高,但是各培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。除陽(yáng)性對(duì)照組外,其余各組培養(yǎng)24h與48h的樣本間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而培養(yǎng)72h與兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。培養(yǎng)72小時(shí)的樣本中,Ta顆粒組及HA顆粒組細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但是Ta顆粒組的細(xì)胞凋亡率與HA顆粒組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：陽(yáng)性對(duì)照組、HA顆粒組和Ta組THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6和TNF-a的水平均高于空白對(duì)照組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而HA顆粒組與Ta組THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6和TNF-a的水平則低于陽(yáng)性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。此外,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各實(shí)驗(yàn)組IL-6和TNF-a的表達(dá)水平均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),但相同處理方法不同培養(yǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1.體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明,Ta顆粒體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)毒級(jí)為1級(jí),屬于臨床可接受范圍,但長(zhǎng)期的生物安全性還需進(jìn)一步動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證。 2.Ta對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。 3.Ta對(duì)THP-1細(xì)胞的IL-6、TNF-a的分泌無(wú)明顯影響,一定程度上減少了部分炎癥因子對(duì)種植體周?chē)浻步M織炎癥、骨組織吸收的不良影響,對(duì)改善種植體的遠(yuǎn)期療效有一定的幫助,為T(mén)a的臨床使用提供了依據(jù)。 4.將Ta引入種植體涂層的開(kāi)發(fā)具有一定的可行性,但其作為涂層的強(qiáng)度及結(jié)合方式等有待進(jìn)一步探索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R783.6

【參考文獻(xiàn)】

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1 秦爽;賀育蘭;楊靜;肖麗;魯猛厚;;重組人生長(zhǎng)激素對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β含量的影響[J];中國(guó)感染控制雜志;2008年01期

2 李偉;與牙種植體有關(guān)的表面處理技術(shù)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);2000年02期

3 丁培杰;段長(zhǎng)恩;張世杰;趙國(guó)強(qiáng);;重組人生長(zhǎng)激素對(duì)人巨噬細(xì)胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α的影響[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

4 戰(zhàn)德松;呂嬌;趙奇;于學(xué)垠;徐孝榮;;磁性附著體中鐵素體不銹鋼引起小鼠成纖維細(xì)胞L929的死亡模式[J];金屬學(xué)報(bào);2006年08期

5 尹大宇;朱慶生;段永宏;張玉萍;;鉭涂層對(duì)Ti-6Al-4V合金抗腐蝕性能的影響[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2010年36期

6 戰(zhàn)德松;王強(qiáng);郝鳳渝;;齒科合金體外培養(yǎng)液中離子析出濃度與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因關(guān)系的探討[J];口腔材料器械雜志;2011年02期

7 聶蓉蓉;朱鋒;沈麗茹;陳治清;;純鈦表面不同厚度微弧氧化膜的形貌及相結(jié)構(gòu)分析[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2010年02期

8 呂曉迎;牙科材料細(xì)胞毒性評(píng)定的新方法（MTT試驗(yàn)）[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;1995年06期

9 李矛;段永宏;尹大宇;朱澍;邵為;朱錦宇;朱慶生;;等離子噴涂鉭涂層人工假體生物相容性研究[J];中國(guó)矯形外科雜志;2011年04期

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本文編號(hào)：1554539