發(fā)布時間：2018-03-01 09:10

  本文關(guān)鍵詞： 仿生再礦化 膠原纖維 自酸蝕粘接劑 牙本質(zhì) 無定形磷酸鈣　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分無定形磷酸鈣(ACP)的制備及其對Ⅰ型膠原的仿生再礦化研究目的:合成含硅并用聚天冬氨酸(PAsp)穩(wěn)定的ACP顆粒(PAsp-Si-ACP),評價其對重組Ⅰ型膠原及脫礦牙本質(zhì)的再礦化性能,并檢測其生物安全性。材料與方法:采用溶液沉淀法制備含硅并用聚天冬氨酸穩(wěn)定的ACP顆粒(PAsp-Si-ACP)和聚天冬氨酸穩(wěn)定的ACP顆粒(PAsp-ACP)。將10 ml的10 mM/L CaCl2 和 480 μg/L PAsp 的混合液與等體積的 6 mM/L Na2HPO4 和 12 mM/L Na2SiO3·9H2O的混合液混合反應(yīng)10分鐘,離心,在30℃真空干燥箱內(nèi)過夜,制得PAsp-Si-ACP顆粒。將10 ml的10 mM/L CaCl2和480μg/L PAsp的混合液與等體積的6 mM/L Na2HP04混合反應(yīng)10分鐘,離心,真空干燥箱內(nèi)過夜,制得PAsp-ACP顆粒。采用透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、X射線光電子能譜(XPS)、傅里葉紅外分析(FTIR)、X射線衍射(XRD)等方法進(jìn)行表征。實驗分為對照組(PAsp-ACP)和實驗組(PAsp-Si-ACP),采用單層重組膠原模型,評價ACP顆粒對Ⅰ型膠原的再礦化能力。將來源于鼠尾的Ⅰ型膠原溶液組裝在400目的透射電鏡鎳網(wǎng)上,制備24個附有重組膠原的TEM鎳網(wǎng)。(1)對照組:將8mg的PAsp-ACP顆粒溶解在240μl的1M HEPES液(pH=7.4)中,超聲混勻,滴在培養(yǎng)皿中形成一個小液滴狀,制備3個小液滴;(2)實驗組:將8mg的PAsp-Si-ACP顆粒溶解在240μ1的1MHEPES液(pH=7.4)中,超聲混勻,滴在培養(yǎng)皿中形成一個小液滴狀,制備3個小液滴。將4個附有重組膠原的TEM鎳網(wǎng)漂浮在一個小液滴上,在37℃C恒溫箱內(nèi)礦化1、4、7天后取出,每組每個時間點取4個樣本。制備6個大小約3 mm×3mm×1 mm的人牙本質(zhì)片,采用37%磷酸酸蝕30 s制備脫礦牙本質(zhì)片,隨機(jī)選取2個樣本用于TEM觀察牙本質(zhì)脫礦后的超微結(jié)構(gòu),余4個用于PAsp-Si-ACP顆粒對脫礦牙本質(zhì)再礦化的實驗。將33.3 mg的PAsp-Si-ACP顆粒分散在1 ml的1M HEPES液(pH=7.4)中,將牙片放入混合液中,1月后取出。樣本均采用透射電鏡(TEM)觀察晶體在膠原內(nèi)沉積的情況,同時采用選區(qū)電子衍射(SAED)觀察晶相情況。采用CCK-8法檢測PAsp-Si-ACP顆粒的細(xì)胞毒性。結(jié)果:透射電鏡和掃描電鏡顯示所合成的PAsp-Si-ACP及PAsp-ACP顆粒為圓球形,大小約為20-80nm。傅里葉紅外及XRD分析顯示所合成的ACP顆粒為無定形相。XPS檢測示PAsp-Si-ACP的組成元素含有Ca、P、O、Si、N、C,PAsp-ACP的組成元素為Ca、P、O、N、C。TEM顯示實驗組PAsp-Si-ACP中,1天的樣本中Ⅰ型膠原纖維大部分礦化,4天和7天的樣本中Ⅰ型膠原幾乎全部礦化,呈纖維內(nèi)和纖維外礦化。而對照組PAsp-ACP中,1天和4天的樣本中,膠原未礦化,7天的樣本中,Ⅰ型膠原僅出現(xiàn)少量的礦化。SAED提示羥基磷灰石沿著膠原纖維的長軸有序地排列,為結(jié)晶相。TEM顯示牙本質(zhì)用37%磷酸酸蝕30 s后形成一個10-15 μm的脫礦層。脫礦牙本質(zhì)再礦化1個月,TEM顯示脫礦牙本質(zhì)出現(xiàn)再礦化,再礦化層約3-5μm厚。CCK-8顯示所合成的PAsp-Si-ACP顆粒具有良好的生物相容性。結(jié)論:PAsp-Si-ACP顆粒對Ⅰ型膠原具有良好的礦化性能,Si對Ⅰ型膠原的礦化具有促進(jìn)作用。PAsp-Si-ACP顆粒具有良好的生物相容性,為臨床上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。第二部分自酸蝕粘接劑作為ACP納米前驅(qū)體的載體對單層重組Ⅰ型膠原的仿生再礦化研究目的:采用單層重組膠原模型,探討自酸蝕粘接劑作為ACP納米前驅(qū)體(固態(tài)PAsp-Si-ACP顆粒)的載體對重組Ⅰ型膠原的礦化性能。材料與方法:PAsp-Si-ACP的合成方法及單層Ⅰ型膠原重組方法同實驗一。選用兩種自酸蝕粘接劑Clearfil S3 Bond(可樂麗公司,日本)和Adper Easy one(3M,美國)作為載體,根據(jù)有無添加PAsp-Si-ACP顆粒分為實驗組和對照組。實驗組:在兩種粘接劑中分別添加5wt%,15wt%,25wt%的PAsp-Si-ACP顆粒,攪拌均勻,制備成直徑約13mm,厚度為0.1mm的礦化薄膜,光照80s(Radii plus,1500mW/cm2,SDI,澳大利亞),固化。對照組:以粘接劑作為空白對照組,制備成直徑約13 mm,厚度為0.1 mm的粘接劑薄膜,光照80s,固化。將礦化薄膜和粘接劑薄膜平放在12孔板底部內(nèi),薄膜上方滴上240μl人工唾液。將128個附有重組膠原的TEM鎳網(wǎng)(n=16個)漂浮在人工唾液上,每個孔內(nèi)漂浮4個TEM鎳網(wǎng),在37℃C恒溫箱內(nèi)礦化1、4、7、14天后取出,每組每個時間點取4個樣品。用透射電鏡(TEM)和選區(qū)電子衍射(SAED))觀察。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定所篩選出的對膠原具有礦化潛能的礦化薄膜在133 mmol/LNaCl、50 mmol/L HEPES、pH =7.4溶液中28天內(nèi)的鈣磷釋放量。結(jié)果:對照組和添加5wt%和15wt%PAsp-Si-ACP的實驗組的樣本中膠原未見明顯礦化。添加25wt%PAsp-Si-ACP的實驗組中發(fā)現(xiàn)第4天的樣本中膠原部分礦化,選區(qū)電子衍射(SAED)顯示仍為無定形相。在第7天的時候膠原出現(xiàn)部分礦化,礦化區(qū)和非礦化區(qū)有明顯的界限。在14天的時候,膠原幾乎全部礦化。選區(qū)電子衍射呈現(xiàn)002晶面,提示晶體沿著膠原纖維的長軸排列。添加25wt%PAsp-Si-ACP的礦化薄膜在28天內(nèi)具有持續(xù)穩(wěn)定的鈣磷釋放量。結(jié)論:在自酸蝕粘接劑中添加25wt%PAsp-Si-ACP顆粒,對重組Ⅰ型膠原具有礦化能力,而且在28天內(nèi)具有持續(xù)穩(wěn)定的鈣磷釋放量。自酸蝕粘接劑可以作為ACP納米前驅(qū)體(固態(tài)PAsp-Si-ACP顆粒)的載體提供仿生再礦化。第三部分自酸蝕粘接劑作為ACP納米前驅(qū)體的載體對脫礦牙本質(zhì)的仿生再礦化研究目的:探討自酸蝕粘接劑作為ACP納米前驅(qū)體(固態(tài)PAsp-Si-ACP顆粒)的載體對脫礦牙本質(zhì)的礦化性能。材料與方法:PAsp-Si-ACP合成方法和脫礦牙本質(zhì)的制備方法同實驗一。制備48個脫礦牙本質(zhì)片,隨機(jī)分成以下4組(n=12):(1)對照組(S3):Clearfil S3 Bond;(2)對照組(AEO):Adper Easy One;(3)實驗組(S3+25wt%PAsp-Si-ACP):在 Clearfil S3 Bond 粘接劑中加入25wt%PAsp-Si-ACP顆粒,充分混勻,避光保存;(4)實驗組(八EO+25wt%PAsP-Si-ACP):在Adper Easy One粘接劑中加入25wt%PAsp-Si-ACP顆粒,充分混勻,避光保存。對照組(組1和組2)嚴(yán)格按照廠家說明,將粘接劑涂在脫礦牙本質(zhì)片表面,光照固化后,在粘接劑表面再覆蓋一薄層流動樹脂。實驗組(組3和組4),將添加有PAsp-Si-ACP的粘接劑涂于脫礦牙本質(zhì)表面后,涂擦20 s,輕吹5 s,光照10 s,在粘接劑表面再覆蓋一薄層流動樹脂。將制備好的樣本放入人工唾液中(15ml/個),放在在37℃C的恒溫水浴培養(yǎng)箱內(nèi),人工唾液每周更換。待1天、1月、3月后取出樣本,每組每個時間點取4個樣本,用透射電鏡(TEM)和選區(qū)電子衍射(SAED)觀察。結(jié)果:透射電鏡顯示對照組(組1和組2)中1天、1月和3月的樣本中脫礦牙本質(zhì)沒有出現(xiàn)再礦化。在實驗組(組3:S3+25wt%PAsp-Si-ACP)中,1天的樣本在脫礦層底部出現(xiàn)約200-300 nm的再礦化層,SAED顯示為微弱的晶相結(jié)構(gòu)。在實驗組(組4:AEO+25wt%PAsp-Si-ACP)中,在1天的樣本中,脫礦層底部未出現(xiàn)再礦化層。但在兩組實驗組的1個月和3個月的樣本中,脫礦層底部都分別出現(xiàn)1.5μm和2 μm的再礦化層。SAED顯示為羥基磷灰石晶相結(jié)構(gòu)。結(jié)論:含25wt%PAsp-Si-ACP的自酸蝕粘接劑可以使脫礦牙本質(zhì)再礦化。自酸蝕粘接劑可以作為ACP納米前驅(qū)體(固態(tài)PAsp-Si-ACP顆粒)的載體提供仿生再礦化。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R783.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1551285