本文關(guān)鍵詞： 堿性成纖維細胞生長因子 基質(zhì)細胞衍生因子 信號通路蛋白 增殖 遷移 抑制劑　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景和目的牙周病最普遍臨床表現(xiàn)為導致牙周支持組織的破壞及骨再生困難,近年來,骨組織工程學在牙周病學治療方面得到廣泛應用研究,因此促進骨再生方面細胞增殖、遷移及成骨是提高該類疾病治愈率的關(guān)鍵。小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Stromal Cell Line,ST2)是一種多能干細胞,取自源于小鼠體內(nèi),研究證明其擁有來源廣泛并在一定條件下具有成脂、成骨、成軟骨細胞能力的特點,因此作為基礎研究中優(yōu)秀的種子細胞也廣為應用在組織工程技術(shù)方面及原位組織工程技術(shù)。堿性成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,bFGF)及基質(zhì)細胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)在牙周組織再生及骨再生領域已得到廣泛研究。在轉(zhuǎn)化醫(yī)學方面,目前種子細胞及生長因子依然在很多方面受限,而原位組織工程技術(shù)(in situ engineering technique)的發(fā)展可以通過募集干細胞作用的各類生長因子有效地解決這一個問題。堿性成纖維細胞生長因子及基質(zhì)細胞衍生因子是近年來的明星生長因子,得到了學術(shù)界的廣泛關(guān)注。很多體內(nèi)實驗研究已證實,bFGF能夠促進細胞增殖及其成骨且效果明顯。SDF-1則是經(jīng)典的趨化因子,對免疫、循環(huán)及中樞系統(tǒng)的發(fā)育有著關(guān)鍵作用,且SDF-1在受傷組織(心臟、腎、大腦、皮膚及骨髓)中高表達,其表達的提高被認為是促進干細胞和前體細胞遷移進行組織修復再生的重要信號。但是對于二者對于ST2細胞增殖遷移的差異并無相關(guān)研究,其細胞機制也不清楚。各種細胞的增殖遷移涉及多條信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié),目前研究較多并得到相關(guān)文獻資料驗證支持的是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase,MAPK)家族外加PI3K/AKT信號通路,其對于細胞增殖、生長、分化、凋亡等生理現(xiàn)象均有顯著作用。本實驗的目的在于為內(nèi)源性干細胞歸巢理論提供依據(jù),bFGF與SDF-1分別處理ST2細胞探究其增殖遷移方面的差異,為組織工程技術(shù)選擇一種更為優(yōu)質(zhì)的生長因子,并探討bFGF如何發(fā)揮其作用機制及相關(guān)信號通路,以及絲裂素活化蛋白激酶家族MAPK及PI3K/AKT是否在細胞增殖遷移中扮演重要的角色且孰輕孰重。材料和方法ST2細胞購自日本Riken Cell Bank,采用體外培養(yǎng)ST2,進行細胞的復蘇、凍存、傳代及培養(yǎng)等操作。細胞培養(yǎng)傳代,倒置相差顯微鏡下觀察,細胞生長狀態(tài)形態(tài)良好,繁殖能力強,即達到實驗要求。1、將ST2細胞分為2組,分別為bFGF實驗組,SDF-1實驗組,相關(guān)文獻參考,bFGF實驗組因子濃度分別設置為0(對照組濃度)、10、20、40、80、100ng/ml,SDF-1實驗組因子濃度分別設置為0(對照組濃度)、50、100、200、400 ng/ml,分別置于無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72h,通過CellConting Kit-8(CCK8)試劑盒檢測不同濃度兩種生長因子對于細胞增殖的影響,獲得增殖ST2細胞的最佳生長因子濃度。2、實驗共分為三組:空白對照組,bFGF組(20ng/ml),SDF-1組(200ng/ml),采用CCK8方法檢測不同濃度兩種因子在24h,48h時間對骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響。3、實驗共分為三組:空白對照組,bFGF 組(20ng/ml),SDF-1 組(200ng/ml),通過 transwell小室法檢測不同濃度兩種因子對骨髓基質(zhì)細胞趨化的影響。4、實驗采用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(western blot)技術(shù),分為用20 ng/mlbFGF刺激培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞0、5、10、15、30、60、120 min,根據(jù)時間進行分組,觀察ST2細胞對于AKT/P-AKT、Erk/P-Erk蛋白相對表達含量的變化。5、實驗采用western blot技術(shù),分別單獨加入PI3K/AKT抑制劑LY294002,Erk抑制劑U0126+bFGF(10 ng/ml)組對ST2細胞進行活化,檢測各通路磷酸化蛋白的表達變化。6、實驗分為兩組:抑制劑LY294002組及抑制劑U0126組,每組又分為單獨抑制劑組、抑制劑+bFGF組,采用CCK8技術(shù)檢測細胞增殖情況變化,transwell小室法及劃痕實驗檢測細胞遷移變化。結(jié)果:1、與空白對照組相比,24h時bFGF實驗組在濃度為10、20、40、80 ng/ml時對于骨髓基質(zhì)細胞系增殖有促進作用(p0.05),相反地在bFGF濃度為100 ng/ml時,表現(xiàn)為高濃度抑制作用(p0.05),且最佳濃度為20ng/ml。SDF-1實驗組在濃度為50、100ng/ml對ST2細胞增殖有效果,濃度為200ng/ml可有效促進細胞增殖最佳(p0.05),相反地濃度為400ng/ml時對ST2細胞增殖表現(xiàn)出高濃度抑制(p0.05),且最佳濃度為200ng/ml。2、經(jīng)CCK8細胞增殖實驗顯示:與空白對照組相比,在24、48、72h時間,20 ng/ml bFGF 和 200 ng/ml SDF-1 均能促進 ST2 細胞增殖(p＜0.01),同時,20 ng/ml bFGF組較之于200ng/mlSDF-1組效果更為顯著(p0.01)。3、經(jīng)transwell小室法檢測,與空白對照組相比,20 ng/ml bFGF和200 ng/ml SDF-1對小鼠骨髓基質(zhì)細胞系ST2均有遷移趨化作用(p0.01),且bFGF的遷移趨化作用較SDF-1更為明顯(p0.01)。4、相同劑量的20 ng/ml bFGF刺激ST2細胞后,隨著作用時間的延長,磷酸化AKT、Erk的表達逐漸升高,分別在30min、15min時磷酸化AKT、Erk表達到頂峰,隨后磷酸化逐漸降低。5、給予ST2細胞關(guān)于PI3K/AKT、MAPK相關(guān)通路Erk特異性阻斷劑進行處理,經(jīng)Western Blot測定驗證,與空白對照組相比,單獨抑制劑組磷酸化蛋白表達含量降低,抑制劑預處理后加生長因子組相關(guān)蛋白磷酸化較空白組升高但與單獨生長因子組比較含量降低。6、將PI3K/AKT,MAPK相關(guān)通路Erk特異性阻斷劑LY294002及U0126對ST2細胞進行處理,CCK8細胞增殖實驗,transwell小室及細胞劃痕實驗均可同等證明PI3K/AKT通路能更好的阻斷細胞的增殖與遷移,加入bFGF生長因子細胞生理狀況不會有明顯改善,但是MAPK/Erk通路可后續(xù)被bFGF生長因子再次激活,促進細胞的增殖、遷移。結(jié)論bFGF和SDF-1處理ST2細胞后,細胞增殖遷移確有增強,最佳有效濃度分別為 20 ng/ml 和 200 ng/ml,且 20 ng/ml bFGF 增殖遷移效果優(yōu)于 200 ng/ml SDF-1。bFGF的增殖遷移機制主要是通過PI3K/AKT通路以及MAPK經(jīng)典通路的Erk調(diào)節(jié)細胞增殖遷移的能力。相反地,特異性阻斷以上通路,ST2細胞的增殖遷移能力現(xiàn)象表達會減弱,且PI3K/AKT通路為主控信號通路,Erk僅為輔助通路。
[Abstract]:Basic fibroblast growth factor ( bFGF ) and stromal cell derived factor ( SDF - 1 ) have been widely used in the field of periodontal tissue regeneration and bone regeneration . The effects of bFGF and SDF - 1 on proliferation of bone marrow stromal cells were investigated . The effects of two factors on proliferation of bone marrow stromal cells were studied by means of cell culture passaging . Results : Compared with blank control group , bFGF and 200 ng / ml SDF - 1 inhibited the proliferation of bone marrow stromal cell line ( P < 0.01 ) . The concentration of bFGF and 200 ng / ml SDF - 1 increased significantly ( P < 0.01 ) . Conclusion bFGF and SDF - 1 can effectively block the proliferation and migration of the cells . The mechanism of proliferation and migration of bFGF and SDF - 1 is better than 200 ng / ml SDF - 1 .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4

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本文編號：1489192