本文關(guān)鍵詞： 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 信號(hào)通路蛋白 增殖 遷移 抑制劑　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的牙周病最普遍臨床表現(xiàn)為導(dǎo)致牙周支持組織的破壞及骨再生困難,近年來,骨組織工程學(xué)在牙周病學(xué)治療方面得到廣泛應(yīng)用研究,因此促進(jìn)骨再生方面細(xì)胞增殖、遷移及成骨是提高該類疾病治愈率的關(guān)鍵。小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cell Line,ST2)是一種多能干細(xì)胞,取自源于小鼠體內(nèi),研究證明其擁有來源廣泛并在一定條件下具有成脂、成骨、成軟骨細(xì)胞能力的特點(diǎn),因此作為基礎(chǔ)研究中優(yōu)秀的種子細(xì)胞也廣為應(yīng)用在組織工程技術(shù)方面及原位組織工程技術(shù)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,bFGF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal cell derived factor-1,SDF-1)在牙周組織再生及骨再生領(lǐng)域已得到廣泛研究。在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面,目前種子細(xì)胞及生長因子依然在很多方面受限,而原位組織工程技術(shù)(in situ engineering technique)的發(fā)展可以通過募集干細(xì)胞作用的各類生長因子有效地解決這一個(gè)問題。堿性成纖維細(xì)胞生長因子及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子是近年來的明星生長因子,得到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。很多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí),bFGF能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖及其成骨且效果明顯。SDF-1則是經(jīng)典的趨化因子,對(duì)免疫、循環(huán)及中樞系統(tǒng)的發(fā)育有著關(guān)鍵作用,且SDF-1在受傷組織(心臟、腎、大腦、皮膚及骨髓)中高表達(dá),其表達(dá)的提高被認(rèn)為是促進(jìn)干細(xì)胞和前體細(xì)胞遷移進(jìn)行組織修復(fù)再生的重要信號(hào)。但是對(duì)于二者對(duì)于ST2細(xì)胞增殖遷移的差異并無相關(guān)研究,其細(xì)胞機(jī)制也不清楚。各種細(xì)胞的增殖遷移涉及多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié),目前研究較多并得到相關(guān)文獻(xiàn)資料驗(yàn)證支持的是絲裂素活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase,MAPK)家族外加PI3K/AKT信號(hào)通路,其對(duì)于細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡等生理現(xiàn)象均有顯著作用。本實(shí)驗(yàn)的目的在于為內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢理論提供依據(jù),bFGF與SDF-1分別處理ST2細(xì)胞探究其增殖遷移方面的差異,為組織工程技術(shù)選擇一種更為優(yōu)質(zhì)的生長因子,并探討bFGF如何發(fā)揮其作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路,以及絲裂素活化蛋白激酶家族MAPK及PI3K/AKT是否在細(xì)胞增殖遷移中扮演重要的角色且孰輕孰重。材料和方法ST2細(xì)胞購自日本Riken Cell Bank,采用體外培養(yǎng)ST2,進(jìn)行細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存、傳代及培養(yǎng)等操作。細(xì)胞培養(yǎng)傳代,倒置相差顯微鏡下觀察,細(xì)胞生長狀態(tài)形態(tài)良好,繁殖能力強(qiáng),即達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。1、將ST2細(xì)胞分為2組,分別為bFGF實(shí)驗(yàn)組,SDF-1實(shí)驗(yàn)組,相關(guān)文獻(xiàn)參考,bFGF實(shí)驗(yàn)組因子濃度分別設(shè)置為0(對(duì)照組濃度)、10、20、40、80、100ng/ml,SDF-1實(shí)驗(yàn)組因子濃度分別設(shè)置為0(對(duì)照組濃度)、50、100、200、400 ng/ml,分別置于無菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24、48、72h,通過CellConting Kit-8(CCK8)試劑盒檢測不同濃度兩種生長因子對(duì)于細(xì)胞增殖的影響,獲得增殖ST2細(xì)胞的最佳生長因子濃度。2、實(shí)驗(yàn)共分為三組:空白對(duì)照組,bFGF組(20ng/ml),SDF-1組(200ng/ml),采用CCK8方法檢測不同濃度兩種因子在24h,48h時(shí)間對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。3、實(shí)驗(yàn)共分為三組:空白對(duì)照組,bFGF 組(20ng/ml),SDF-1 組(200ng/ml),通過 transwell小室法檢測不同濃度兩種因子對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞趨化的影響。4、實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)技術(shù),分為用20 ng/mlbFGF刺激培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞0、5、10、15、30、60、120 min,根據(jù)時(shí)間進(jìn)行分組,觀察ST2細(xì)胞對(duì)于AKT/P-AKT、Erk/P-Erk蛋白相對(duì)表達(dá)含量的變化。5、實(shí)驗(yàn)采用western blot技術(shù),分別單獨(dú)加入PI3K/AKT抑制劑LY294002,Erk抑制劑U0126+bFGF(10 ng/ml)組對(duì)ST2細(xì)胞進(jìn)行活化,檢測各通路磷酸化蛋白的表達(dá)變化。6、實(shí)驗(yàn)分為兩組:抑制劑LY294002組及抑制劑U0126組,每組又分為單獨(dú)抑制劑組、抑制劑+bFGF組,采用CCK8技術(shù)檢測細(xì)胞增殖情況變化,transwell小室法及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移變化。結(jié)果:1、與空白對(duì)照組相比,24h時(shí)bFGF實(shí)驗(yàn)組在濃度為10、20、40、80 ng/ml時(shí)對(duì)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞系增殖有促進(jìn)作用(p0.05),相反地在bFGF濃度為100 ng/ml時(shí),表現(xiàn)為高濃度抑制作用(p0.05),且最佳濃度為20ng/ml。SDF-1實(shí)驗(yàn)組在濃度為50、100ng/ml對(duì)ST2細(xì)胞增殖有效果,濃度為200ng/ml可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖最佳(p0.05),相反地濃度為400ng/ml時(shí)對(duì)ST2細(xì)胞增殖表現(xiàn)出高濃度抑制(p0.05),且最佳濃度為200ng/ml。2、經(jīng)CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示:與空白對(duì)照組相比,在24、48、72h時(shí)間,20 ng/ml bFGF 和 200 ng/ml SDF-1 均能促進(jìn) ST2 細(xì)胞增殖(p＜0.01),同時(shí),20 ng/ml bFGF組較之于200ng/mlSDF-1組效果更為顯著(p0.01)。3、經(jīng)transwell小室法檢測,與空白對(duì)照組相比,20 ng/ml bFGF和200 ng/ml SDF-1對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST2均有遷移趨化作用(p0.01),且bFGF的遷移趨化作用較SDF-1更為明顯(p0.01)。4、相同劑量的20 ng/ml bFGF刺激ST2細(xì)胞后,隨著作用時(shí)間的延長,磷酸化AKT、Erk的表達(dá)逐漸升高,分別在30min、15min時(shí)磷酸化AKT、Erk表達(dá)到頂峰,隨后磷酸化逐漸降低。5、給予ST2細(xì)胞關(guān)于PI3K/AKT、MAPK相關(guān)通路Erk特異性阻斷劑進(jìn)行處理,經(jīng)Western Blot測定驗(yàn)證,與空白對(duì)照組相比,單獨(dú)抑制劑組磷酸化蛋白表達(dá)含量降低,抑制劑預(yù)處理后加生長因子組相關(guān)蛋白磷酸化較空白組升高但與單獨(dú)生長因子組比較含量降低。6、將PI3K/AKT,MAPK相關(guān)通路Erk特異性阻斷劑LY294002及U0126對(duì)ST2細(xì)胞進(jìn)行處理,CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),transwell小室及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)均可同等證明PI3K/AKT通路能更好的阻斷細(xì)胞的增殖與遷移,加入bFGF生長因子細(xì)胞生理狀況不會(huì)有明顯改善,但是MAPK/Erk通路可后續(xù)被bFGF生長因子再次激活,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移。結(jié)論bFGF和SDF-1處理ST2細(xì)胞后,細(xì)胞增殖遷移確有增強(qiáng),最佳有效濃度分別為 20 ng/ml 和 200 ng/ml,且 20 ng/ml bFGF 增殖遷移效果優(yōu)于 200 ng/ml SDF-1。bFGF的增殖遷移機(jī)制主要是通過PI3K/AKT通路以及MAPK經(jīng)典通路的Erk調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖遷移的能力。相反地,特異性阻斷以上通路,ST2細(xì)胞的增殖遷移能力現(xiàn)象表達(dá)會(huì)減弱,且PI3K/AKT通路為主控信號(hào)通路,Erk僅為輔助通路。
[Abstract]:Basic fibroblast growth factor ( bFGF ) and stromal cell derived factor ( SDF - 1 ) have been widely used in the field of periodontal tissue regeneration and bone regeneration . The effects of bFGF and SDF - 1 on proliferation of bone marrow stromal cells were investigated . The effects of two factors on proliferation of bone marrow stromal cells were studied by means of cell culture passaging . Results : Compared with blank control group , bFGF and 200 ng / ml SDF - 1 inhibited the proliferation of bone marrow stromal cell line ( P < 0.01 ) . The concentration of bFGF and 200 ng / ml SDF - 1 increased significantly ( P < 0.01 ) . Conclusion bFGF and SDF - 1 can effectively block the proliferation and migration of the cells . The mechanism of proliferation and migration of bFGF and SDF - 1 is better than 200 ng / ml SDF - 1 .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：1489192