發(fā)布時間：2018-01-01 00:00

  本文關鍵詞：高壓氧促進炎性髁突軟骨細胞外基質表達作用的研究　出處：《山東大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：探討高壓氧調節(jié)P13K/AKT信號通路促進炎性髁突軟骨細胞表達細胞外基質的作用。方法：體外培養(yǎng)3-4周SD大鼠髁突軟骨細胞。在無菌環(huán)境下,取雙側髁突,以含有雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖刷并剝離軟骨,反復剪切至1mm3大小,首先在37℃環(huán)境下用0.25%濃度的胰蛋白酶消化30分鐘,然后37℃振蕩加入濃度為0.2%的Ⅱ型膠原酶,1-2小時消化完后、分離原代軟骨細胞并培養(yǎng),通過倒置顯微鏡每天觀測原代軟骨細胞生長、形態(tài)變化,并用細胞形態(tài)學、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色、Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)結果。隨機將第2代處于對數(shù)生長期髁突軟骨細胞分為四組,分別用0、0.1、1、10ng/ml IL-1β處理24小時,對各組之間Ⅱ型膠原、AGG蛋白和ⅠnRNA表達量進行檢測,并篩選出能造成髁突軟骨細胞炎性狀態(tài)的IL-1β最佳濃度；取第2代處于對數(shù)生長期髁突軟骨細胞隨機分為四組：對照組,細胞不做任何處理；IL-1β組,lOng/ml IL-1β處理24小時；HBO組,lOng/ml IL-1β處理24小時后HBO每天處理90分鐘,共四天。Inhibitor+HBO 組:10ng/ml IL-1β處理24小時,提前一小時加入25uMLY294002(PI3K抑制劑)后HBO每天處理90分鐘,共四天。分別用CCK-8法檢測各組細胞增殖活性；western blotting、免疫組化或者免疫熒光檢測各組之間collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT的蛋白表達量；qRT-PCR檢測各組collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT mRNA表達量。結果：(1)消化髁突,提取軟骨細胞接種,觀察見細胞呈形態(tài)規(guī)則、小球形。一天后,多數(shù)細胞貼附于培養(yǎng)瓶底,鏡下觀察可呈多角形；5天后,可觀察到“鋪路石”樣外觀,培養(yǎng)瓶底面被80%左右的細胞鋪滿。經(jīng)一次傳代后,細胞貼壁速度明顯加快,勻稱分布,當細胞長滿,再次傳代；據(jù)我們觀察在3代以內,軟骨細胞增殖速率快,在此以后,髁突軟骨細胞呈長梭形,出現(xiàn)“去極化”現(xiàn)象,生長速度明顯變緩。胞漿內可見有棕黃色顆粒和紅色熒光顆粒經(jīng)Ⅱ型膠原免疫細胞化學和細胞免疫熒光染色。(2) 10ng/ml IL-1β降低髁突軟骨細胞Ⅱ型膠原和AGG表達的效果最明顯。(3)高壓氧干預炎性髁突軟骨細胞后,細胞增殖活性明顯增高,collagen Ⅱ、AGG, p-PI3K 和 p-Akt表達水平明顯升高；高壓氧干預并加入PI3K抑制劑后,髁突軟骨細胞增殖活性降低,collagen Ⅱ、AGG、p-PI3K和p-Akt表達水平下降。結論：高壓氧通過PI3K/Akt通路促進炎性髁突軟骨細胞表達細胞外基質、升高軟骨細胞的增殖活性,為臨床治療TMJ-OA提供新方式。
[Abstract]:Objective: to investigate the role of hyperbaric oxygen in regulating P13K / AKT signaling pathway to promote the expression of extracellular matrix in inflammatory condylar chondrocytes. Condylar chondrocytes of SD rats were cultured in vitro for 3-4 weeks. The condyle of both sides was taken and washed with phosphate buffer solution (PBS) containing double antibodies. The cartilage was repeatedly cut to the size of 1mm3. At 37 鈩，

本文編號：1362016