本文關(guān)鍵詞：N-cadherin對人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移及成牙本質(zhì)向分化的作用研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景和目的牙髓牙本質(zhì)作為一個復(fù)合體,具有一定的修復(fù)再生能力,當(dāng)牙髓受到感染、外傷、物理和化學(xué)等刺激時,牙髓組織中所含有的牙髓干細(xì)胞可增殖、遷移到受損部位,并分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞,形成修復(fù)性牙本質(zhì),保護牙髓免受進(jìn)一步的傷害。而當(dāng)刺激超過牙髓防御反應(yīng)所能承受的閾值時,可進(jìn)一步發(fā)展為牙髓炎或根尖周炎。以控制感染、促進(jìn)根尖周病愈合為主要目的根管治療術(shù)是目前的主要治療方法,但是其并不能恢復(fù)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的活性和功能,而隨著對牙髓生物學(xué)研究的不斷深入,再生性牙髓治療(regenerative endodontics)逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注,其中當(dāng)前研究較多并運用于臨床的是牙髓血運重建(revascularization),但是其并非真正意義上的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生,因為在組織學(xué)上觀察發(fā)現(xiàn)形成的組織具有牙周來源性質(zhì),并且無以成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞覆蓋于牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)表面為特征的牙髓樣組織的形成。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)是從牙髓組織中分離出來的具有自我更新和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞,無論是在牙髓組織損傷修復(fù),還是在牙髓再生過程中,DPSCs的成牙本質(zhì)向分化都是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,其受到復(fù)雜信號分子通路的調(diào)控,但是其中的機制至今仍未闡明。由細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞.細(xì)胞間和細(xì)胞.基質(zhì)間的相互作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要機制,前者主要由鈣黏蛋白(cadherins)所介導(dǎo),而后者則主要由整合素(integrins)介導(dǎo)。鈣黏蛋白是一類介導(dǎo)鈣依賴型細(xì)胞間黏附的黏附分子超家族,包括經(jīng)典鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白、原鈣黏蛋白、七次跨膜鈣黏蛋白和FAT樣鈣黏蛋白等。其中N-cadherin屬于經(jīng)典鈣黏蛋白家族中的一員。N-cadherin不僅參與介導(dǎo)細(xì)胞間黏附,還可涉及多種信號通路,參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化等生理過程。目前對N-cadherin的研究主要集中在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和成骨細(xì)胞的分化方面。研究報道,N-cadherin可與成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)相互作用,減少配體介導(dǎo)的FGFR下調(diào),持續(xù)激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)／細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信號通路,引起基質(zhì)金屬蛋白酶.9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)轉(zhuǎn)錄增加,繼而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。而在成骨細(xì)胞方面,N-cadherin可直接與Wnt共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6 (low density lipoprotein receptor-related protein 5/6, LRP5/LRP6)相互作用,抑制Wnt/β-catenin信號通路,從而抑制成骨細(xì)胞分化和減少骨形成。N-cadherin在牙齒發(fā)育和牙髓組織損傷修復(fù)中的作用亦有報道,研究顯示N-cadherin在人牙齒發(fā)育過程中表達(dá)于正在分化和功能性的成牙本質(zhì)細(xì)胞,并且N-cadherin高表達(dá)于齲損或損傷周圍形成修復(fù)性牙本質(zhì)的成牙本質(zhì)細(xì)胞。以上結(jié)果提示,N-cadherin可能在牙齒發(fā)育和牙髓組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用。然而,牙髓細(xì)胞中是否有N-cadherin的表達(dá)尚存在爭議,并且N-cadherin對人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)生理功能的影響尚不明確。因此,本課題旨在明確N-cadherin在hDPSCs中的表達(dá)和定位,研究N-cadherin對hDPSCs增殖、遷移以及成牙本質(zhì)向分化的作用,闡明N-cadherin在牙髓組織損傷修復(fù)中的作用,同時為牙髓再生提供理論依據(jù)。方 法1. N-cadherin在人牙髓干細(xì)胞中的表達(dá)收集13-25歲志愿者因正畸或阻生需要而拔除的新鮮無齲損、無牙周病的健康前磨牙或第三磨牙,采用組織塊酶消化法體外分離培養(yǎng)hDPSCs;取生長狀態(tài)良好的hDPSCs,制作細(xì)胞爬片,采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá),進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定；胰酶消化收集生長狀態(tài)良好的hDPSCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物；采用含有100 nM地塞米松、50 mg/L抗壞血酸、10 mM β-甘油磷酸鈉的成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基對hDPSCs進(jìn)行牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)14 d后,茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成能力；采用含有1μM地塞米松、200μM吲哚美辛、0.5 mM 3-異丁基-1甲基黃嘌呤(IBMX)、10μg/mL胰島素的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基對hDPSCs進(jìn)行成脂向分化誘導(dǎo)21d后,油紅O染色檢測脂滴形成情況。TRIzol法提取hDPSCs,總RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測hDPSCs中N-cadherin mRNA的表達(dá)情況；取生長狀態(tài)良好的hDPSCs,制作細(xì)胞爬片,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測N-cadherin在hDPSCs中的表達(dá)和定位；對hDPSCs進(jìn)行成牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)7 d和14 d,分別提取誘導(dǎo)組和對照組總RNA,實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time quantitative polymerase chain reaction, Real time PCR)檢測hDPSCs成牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)后N-cadherin表達(dá)量的變化。2.抑制N-cadherin表達(dá)對人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化的影響制備N-cadherin shRNA'慢病毒；根據(jù)完全培養(yǎng)基(complete medium, CM)(含100mL/L FBS的DMEM)、感染增強液(enhanced infection solution, Enis)、 MOI(10、25、50)、polybrene(5 μg/mL)的不同分為12組,摸索N-cadherin ShRNA慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs的最佳條件；根據(jù)最佳轉(zhuǎn)染條件對P3 hDPSCs進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染,72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,并分別提取各組hDPSCs總RNA和總蛋白,Real time PCR和Western blot分別從mRNA和蛋白水平驗證抑制N-cadherin表達(dá)的效率,構(gòu)建N-cadherin表達(dá)抑制hDPSCs模型。對WT組、ShRNA-Ctrl組和ShRNA-N-cad組hDPSCs進(jìn)行成牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)后,采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色檢測ALP活性,茜素紅染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成能力；此外,采用Real time PCR和Western blot檢測成牙本質(zhì)相關(guān)基因ALP、骨鈣素(osteocalcin, OCN)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein 1, DMP1)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)的表達(dá)和可能信號分子β-catenin的表達(dá),研究抑制N-cadherin表達(dá)對hDPSCs成牙本質(zhì)向分化的影響。3.抑制N-cadherin表達(dá)對人牙髓干細(xì)胞增殖和遷移的影響將生長狀態(tài)良好的P3 WT組、ShRNA-Ctrl組與ShRNA-N-cad組hDPSCs接種于96孔板,CCK-8法檢測第1.8 d相同時間點450 nm波長處光密度值(optical density, OD),繪制細(xì)胞生長曲線：胰酶消化收集各組hDPSCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡,研究N-cadherin表達(dá)抑制后hDPSCs的增殖情況。分別將5x104個WT組、ShRNA-Ctrl組和ShRNA-N-cad組hDPSCs接種于Transwell小室的上室,其中上室加入無血清培養(yǎng)基200 I.tL,下室加入完全培養(yǎng)基600 μL,20 h后觀察并分析穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量,檢測N-cadherin表達(dá)抑制對hDPSCs遷移能力的影響；同時采用Real time PCR檢測各組hDPSCs趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子.1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)和CXC趨化因子受體4(CXC receptor 4, CXCR4)的表達(dá)情況。結(jié) 果1.人牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定實驗所分離培養(yǎng)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好,呈成纖維細(xì)胞樣。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示波形絲蛋白表達(dá)陽性,角蛋白表達(dá)陰性,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD29陽性表達(dá)率分別為100%、99.9%、94.7%,造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45、CD31、CD34陽性表達(dá)率為分別0.47%、0.13%、0.16%。成牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)14 d后,茜素紅染色顯示有大量大小不等的紅褐色礦化結(jié)節(jié)形成：成脂向分化誘導(dǎo)21 d后,油紅O染色顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)有橘紅色脂滴形成。2. N-cadherin在人牙髓干細(xì)胞中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示hDPSCs中有N-cadherin mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,N-cadherin在hDPSCs的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。hDPSCs成牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)7 d和14 d后,誘導(dǎo)組N-cadherin的表達(dá)與對照組相比均顯著下調(diào)。3. N-cadherin表達(dá)抑制人牙髓干細(xì)胞模型的構(gòu)建成功制備N-cadherin ShRNA慢病毒,轉(zhuǎn)染hDPSCs的最佳條件為完全培養(yǎng)基、polybrene 5μg/mL、MOI=25。N-cadherin ShRNA慢病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs 72 h后,倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上, Real time PCR和Western blot結(jié)果顯示,hDPSCs中N-cadherin mRNA和蛋白水平的表達(dá)均受到顯著抑制。4.抑制N-cadherin表達(dá)對人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化的影響成牙本質(zhì)向分化誘導(dǎo)后,Real time PCR和Western blot結(jié)果顯示,相對于ShRNA-Ctrl組,ShRNA-N-cad組成牙本質(zhì)相關(guān)基因ALP、OCN、DMP1和DSPP的表達(dá)均顯著上調(diào),同時β-catenin表達(dá)亦明顯增加,并且堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量亦顯著提高。5.抑制N-cadherin表達(dá)對人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8結(jié)果顯示ShRNA-N-cad組與ShRNA-Ctrl組相比,細(xì)胞增殖活性以第5 d為轉(zhuǎn)折點,呈先增高后降低的趨勢。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,在第6 d,與ShRNA-Ctrl組比較,ShRNA-N-cad組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加,而S期和G2/M期細(xì)胞比例則明顯減小,并且ShRNA-N-cad組凋亡細(xì)胞比例顯著高于ShRNA-Ctrl組。6.抑制N-cadherin表達(dá)對人牙髓干細(xì)胞遷移能力的影響Transwell結(jié)果顯示ShRNA-N-cad組穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量顯著多于ShRNA-Ctrl組。Real time PCR結(jié)果顯示,與ShRNA-Ctrl組相比,ShRNA-N-cad組SDF.1和CXCR4的表達(dá)量均顯著增加。結(jié) 論1.成功體外分離培養(yǎng)hDPSCs,其來源于間充質(zhì),具有成牙本質(zhì)向分化和成脂向分化潛能。2. hDPSCs中有N-cadherin的表達(dá),并且主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。3.成功構(gòu)建N-cadherin表達(dá)抑制hDPSCs模型。4.抑制N-cadherin表達(dá)可能通過激活β-catenin信號通路而促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)向分化。5.抑制N-cadherin表達(dá)可影響hDPSCs的增殖能力。6.抑制N-cadherin表達(dá)可能通過上調(diào)SDF-1/CXCR4的表達(dá)而促進(jìn)hDPSCs的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781

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本文編號：1315851