本文關(guān)鍵詞：小鼠DC體內(nèi)遷移的示蹤及腫瘤DRibbles負(fù)載DC疫苗抗口腔鱗癌移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 口腔鱗狀細(xì)胞癌 樹突狀細(xì)胞 超順磁氧化鐵 細(xì)胞示蹤 自噬體 抗腫瘤免疫

【摘要】：背景：目前手術(shù)、放化療等傳統(tǒng)療法在進(jìn)一步提高口腔鱗癌患者5年生存率方面進(jìn)入了瓶頸期,因此免疫治療、基因治療、靶向治療等生物治療手段越來越受到臨床醫(yī)生和基礎(chǔ)研究者的關(guān)注。腫瘤免疫治療是腫瘤生物治療的主要手段之一,其目的是激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體自身免疫能力達(dá)到治療腫瘤。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)是機(jī)體內(nèi)抗原遞呈能力最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,是免疫系統(tǒng)的樞紐。然而許多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者DC數(shù)量減少、功能和表型受損。因此體外制備腫瘤DC疫苗回輸給腫瘤患者成為研究熱點(diǎn)之一。腫瘤DC疫苗發(fā)揮抗腫瘤療效的關(guān)鍵在于DC疫苗能有效遷移到引流淋巴組織,遞呈腫瘤抗原給初始T細(xì)胞,啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答�；剌擠C在體內(nèi)向淋巴組織的遷移效率是腫瘤DC疫苗啟動(dòng)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵因素。我們的前期研究中用合成的超順磁氧化鐵(Superparamagnetic iron oxide, SPIO)對(duì)DC進(jìn)行標(biāo)記示蹤,發(fā)現(xiàn)SPIO對(duì)DC有良好的生物相容性,但僅有少數(shù)標(biāo)記后的DC在回輸后遷移到引流淋巴結(jié)。因此需要進(jìn)一步研究SPIO對(duì)DC在體內(nèi)遷移效率的影響,明確SPIO是否能夠作為臨床觀察DC疫苗遷移分布的示蹤劑。DC疫苗負(fù)載的抗原類型是腫瘤DC疫苗啟動(dòng)抗腫瘤免疫的另一關(guān)鍵因素。目前腫瘤凍融裂解物(Lysate)負(fù)載DC法是最傳統(tǒng)的腫瘤全抗原負(fù)載DC的方法,但其療效尚不盡如人意。自噬是細(xì)胞普遍存在的降解受損或無用的大分子維持自穩(wěn)的生理過程。腫瘤細(xì)胞主要通過泛素化-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑降解腫瘤抗原,而能被MHCI類分子直接遞呈的抗原肽主要來源于通過蛋白酶體降解的腫瘤抗原(尤其包括有缺陷的核糖體產(chǎn)物,即Defective ribosomal products, DRiPs)。通過自噬誘導(dǎo)劑、蛋白酶體抑制劑、溶酶體抑制劑處理腫瘤細(xì)胞,分離出的包含未降解的腫瘤全抗原(包括大量DRiPs)的小泡狀自噬體被稱為DRibbles (DRiPs in blebs),可作為新型腫瘤抗原。雖然DRibbles在多項(xiàng)研究中被證實(shí)是腫瘤抗原的有效攜帶者,但其中被交叉遞呈的腫瘤抗原成分的本質(zhì)存在爭議。而口腔癌細(xì)胞系來源DRibbles是否能夠作為新型抗原提高DC疫苗對(duì)腫瘤的療效還需進(jìn)一步研究。DRibbles負(fù)載DC疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的機(jī)制以及DRibbles疫苗是否需要DC作為載體發(fā)揮抗腫瘤作用尚不明確。目的：1.觀察SPIO標(biāo)記的小鼠DC在體內(nèi)遷移及其效率。2.建立小鼠口腔鱗癌細(xì)胞系(SCC7)自噬性抗原(Dribbles)的制備方法并觀察其刺激T、B細(xì)胞增殖活化的作用。3.評(píng)價(jià)DRibbles對(duì)DC抗原遞呈功能的影響并觀察其負(fù)載DC疫苗對(duì)荷瘤C3H/HeJ小鼠的療效。4.評(píng)估DRibbles負(fù)載DC疫苗對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞株沖擊遺傳背景相同小鼠的保護(hù)性免疫效果。方法：1.誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC,對(duì)其純度進(jìn)行檢測(cè)。用不同濃度SPIO標(biāo)記EGFP-DC,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行普魯士藍(lán)染色及平均含鐵量測(cè)定研究DC對(duì)SPIO攝取情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面分子表達(dá)、凋亡比例、表達(dá)EGFP的熒光強(qiáng)度。不同濃度SPIO標(biāo)記的EGFP-DC在小鼠足墊注射后24小時(shí),用光學(xué)成像、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)引流淋巴結(jié)EGFP熒光信號(hào)。SPIO標(biāo)記的EGFP-DC及SPIO未標(biāo)記的EGFP-DC對(duì)小鼠足墊注射后不同時(shí)間,用光學(xué)成像、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)引流淋巴結(jié)EGFP熒光信號(hào)。2.小鼠口腔鱗癌細(xì)胞系SCC7誘導(dǎo)自噬不同時(shí)間,免疫印跡法檢測(cè)自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ的表達(dá)。SCC7誘導(dǎo)自噬24小時(shí)分離自噬性抗原DRibbles,用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)、掃描電鏡觀察其表面形態(tài)。SCC7反復(fù)凍融法制備Lysate。CCK-8法檢測(cè)不同濃度DRibbles刺激后脾臟細(xì)胞及淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖活力；檢測(cè)DRibbles或Lysate刺激后脾臟細(xì)胞及淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖活力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度DRibbles刺激后脾臟細(xì)胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg細(xì)胞比例；檢測(cè)DRibbles或Lysate刺激后脾臟及淋巴結(jié)B細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)。不同劑量DRibbles經(jīng)腹股溝淋巴結(jié)注射免疫小鼠7天后,對(duì)腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴結(jié)CD4+IFN-γ+T細(xì)胞及CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比例,ELISA檢測(cè)DRibbles再刺激后腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞和脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清的IFN-γ水平。3.激光共聚焦顯微鏡觀察DC對(duì)CFSE標(biāo)記DRibbles的吞噬。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度DRibbles刺激后DC的凋亡比例；檢測(cè)DRibbles刺激不同時(shí)間后DC的凋亡比例；檢測(cè)DRibbles或Lysate刺激后DC的凋亡比例：檢測(cè)不同濃度DRibbles刺激后DC表面標(biāo)志的表達(dá)；檢測(cè)DRibbles或Lysate刺激后DC表面標(biāo)志的表達(dá)。用DRibbles或Lysate負(fù)載的DC進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),CCK-8法檢測(cè)不同抗原負(fù)載的DC刺激后T細(xì)胞的增殖活力。DRibbles或Lysate負(fù)載的DC疫苗加強(qiáng)免疫荷瘤小鼠,對(duì)小鼠進(jìn)行生存觀察和測(cè)量腫瘤大小。4.不同劑量DRibbles負(fù)載的DC疫苗加強(qiáng)免疫正常小鼠,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠PBMC.脾臟細(xì)胞、腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞中CD4+IFN-γ+T細(xì)胞及CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比例；免疫磁珠分選脾臟、淋巴結(jié)T細(xì)胞用于靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn),檢測(cè)效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)SCC7的細(xì)胞毒性；ELISA檢測(cè)小鼠血漿及靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中的上清液IFN-γ水平。DRibbles、DRibble-DC、Lysate-DC、DC分別加強(qiáng)免疫小鼠后,用SCC7對(duì)小鼠進(jìn)行沖擊,而后對(duì)小鼠進(jìn)行生存觀察和測(cè)量腫瘤大��；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及淋巴結(jié)細(xì)胞中Treg細(xì)胞比例；ELISA檢測(cè)淋巴結(jié)和脾臟細(xì)胞經(jīng)DRibbles再刺激后培養(yǎng)上清IFN-γ水平。結(jié)果：1.誘導(dǎo)培養(yǎng)至第7天的小鼠骨髓來源DC中CD11c+細(xì)胞比例達(dá)80%以上。隨著SPIO標(biāo)記濃度的提高,細(xì)胞內(nèi)含鐵量逐漸增加,然而DC表面CD40、CD80、CD86、MHCII類分子、MHCI類分子的表達(dá)無顯著性變化,CCR7的表達(dá)逐漸降低(P＜0.05)；DC的凋亡比例無顯著改變；DC的EGFP熒光強(qiáng)度沒有顯著改變。DC回輸小鼠體內(nèi)后24小時(shí),隨著SPIO標(biāo)記濃度的提高,DC遷移到初級(jí)引流淋巴結(jié)的效率逐漸降低。SPIO標(biāo)記EGFP-DC組和未標(biāo)記的EGFP-DC組在回輸后第7天時(shí)胭窩淋巴結(jié)EGFP+細(xì)胞最多,第14天EGFP+細(xì)胞減少,但兩組間無顯著性差異。在第4、7天SPIO標(biāo)記EGFP-DC組腹股溝淋巴結(jié)能檢測(cè)到EGFP+細(xì)胞,而SPIO未標(biāo)記的EGFP-DC組各時(shí)間點(diǎn)腹股溝淋巴結(jié)均未能檢測(cè)到EGFP+細(xì)胞。2.SCC7誘導(dǎo)自噬、抑制蛋白酶體活性和溶酶體活性24小時(shí)自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ的蛋白水平表達(dá)上調(diào)為對(duì)照組的2.82倍,且高于12小時(shí)組及顯著高于36小時(shí)組(P＜0.01)。DRibbles富含大量自噬體結(jié)構(gòu),直徑約200-900nm不等。10μg/ml DRibbles刺激淋巴細(xì)胞增殖作用在各濃度組中最強(qiáng)(P0.001)。DRibbles刺激淋巴細(xì)胞增殖作用顯著強(qiáng)于Lysate(P0.001)。10 μg/ml DRibbles刺激后脾臟T細(xì)胞比例上調(diào)達(dá)68.12%,顯著高于其他濃度組(P0.05)：其中CD4+細(xì)胞約占41.26%,CD8+細(xì)胞約占28.66%,均高于其他濃度組。DRibbles比Lysate更能顯著下調(diào)脾臟細(xì)胞Treg細(xì)胞比例至1.08%(P0.01)。DRibbles比Lysate更能顯著上調(diào)B細(xì)胞表面CD40、CD80、CD86、MHCII類分子的表達(dá)(P 0.05)。2.5μg DRibbles經(jīng)淋巴結(jié)注射免疫的小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞CD4+IFN-γ+T細(xì)胞比例增加至1.16%,CD8+IFN-γ+T細(xì)胞比例增加至0.53%,淋巴結(jié)細(xì)胞和脾臟細(xì)胞再刺激后分泌IFN-γ分別高達(dá)1086.45 pg/ml和142.04 pg/ml,均高于其他劑量免疫組。3.共孵育6小時(shí)即可觀察到大部分DC吞噬了CFSE標(biāo)記的DRibbles。不同濃度DRibbles和其不同刺激時(shí)間對(duì)DC凋亡無顯著性影響(PO.05)。DRibbles及Lysate負(fù)載DC對(duì)其凋亡則無組間顯著性差異(P0.05)。不同濃度DRibbles能顯著上調(diào)DC表面CD40、CD86、MHCI類分子的表達(dá)水平,表達(dá)陽性的細(xì)胞比例隨著DRibbles濃度的加大而逐漸增加。不同濃度DRibbles刺激DC后MHCⅡ類分子的表達(dá)則無顯著性變化(P0.05)。與Lysate組和對(duì)照組相比,DRibbles負(fù)載的DC表達(dá)CD40、CD86、MHC I類分子顯著上調(diào)(P0.05),而MHCⅡ類分子在各組中的表達(dá)無顯著差異(P0.05)。DRibble-DC比Lysate-DC具有更強(qiáng)的在體外刺激T細(xì)胞增殖的能力(P0.05),且加入促成熟因子后這種差異更加顯著(P0.01)。與Lysate-DC及對(duì)照組相比,DRibble-DC能顯著提高荷瘤小鼠生存率至87.5%,抑制腫瘤生長。4.以2.5μg/ml DRibbles負(fù)載的DC疫苗免疫組小鼠脾臟來源T細(xì)胞及淋巴結(jié)來源T細(xì)胞對(duì)SCC7的細(xì)胞毒性分別高達(dá)52.85%和66.14%,均高于其他濃度負(fù)載組；血漿IFN-γ水平為7.04 pg/ml,脾臟細(xì)胞T細(xì)胞及淋巴結(jié)T細(xì)胞再刺激后上清IFN-γ水平分別為7.59 pg/ml和13.89 pg/ml,均高于其他濃度負(fù)載組；PBMC中CD8+IFN-γ+T細(xì)胞達(dá)3.68%,CD4+IFN-γ+細(xì)胞占T細(xì)胞的比例達(dá)7.35%,脾臟中CD4+IFN-γ+細(xì)胞占T細(xì)胞的比例達(dá)2.19%,淋巴結(jié)中CD8+IFN-γ+細(xì)胞占T細(xì)胞的比例達(dá)2.38%,CD4+IFN-γ+田胞占T細(xì)胞的比例達(dá)5.44%,均高于其他濃度負(fù)載組。DRibbles負(fù)載的DC疫苗能顯著提高腫瘤沖擊后小鼠的生存率至90%(P＜0.05),抑制腫瘤生長(P＜0.05),降低PBMC及淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞比例分別至7.04%和8.31%。DRibbles負(fù)載的DC疫苗免疫組小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞、脾臟細(xì)胞用DRibbles再刺激后分泌工FN-γ,水平分別為862.9 pg/ml和309.5 pg/ml,顯著高于其他疫苗免疫組(P0.05)。結(jié)論：1.不同濃度SPIO標(biāo)記的DC,盡管其含鐵量不同,但其表面CD40、CD80、CD86、 MHC Ⅱ、MHC Ⅰ類分子的表達(dá)水平尚未見到明顯改變,細(xì)胞凋亡也無顯著差異。雖然從短期(24小時(shí))觀察來看,隨著SPIO標(biāo)記濃度的升高,DC表達(dá)CCR7比例和遷移到初級(jí)引流淋巴結(jié)的數(shù)量逐漸減少,但從長期(14天)觀察來看,SPIO標(biāo)記的DC與未標(biāo)記DC遷移到初級(jí)引流淋巴結(jié)的數(shù)量無顯著差異,而SPIO標(biāo)記的DC遷移到次級(jí)引流淋巴結(jié)的數(shù)量則顯著高于未標(biāo)記DC。SPIO標(biāo)記的DC與未標(biāo)記DC均在第7天遷移到初級(jí)引流淋巴結(jié)的數(shù)量最多,到第14天數(shù)量顯著減少。2.建立了小鼠口腔鱗癌細(xì)胞系來源DRibbles的制備方法,誘導(dǎo)分離獲得的DRibbles富含自噬體。DRibbles作為新型腫瘤抗原,在體外能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖活化,減少抑制性T細(xì)胞的比例。DRibbles在低劑量下直接免疫小鼠就能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng),但過高劑量的DRibbles直接免疫小鼠誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)度反而不及低劑量組。3.DRibbles以不同濃度及不同時(shí)間刺激DC對(duì)其凋亡無顯著影響。DRibbles能顯著上調(diào)DC表面CD40、CD86、MHC Ⅰ類分子的表達(dá),上調(diào)程度呈劑量依賴性,對(duì)MHCⅡ類分子的表達(dá)無顯著影響。DRibbles比傳統(tǒng)腫瘤凍融裂解抗原更能促進(jìn)DC遞呈抗原,刺激T細(xì)胞增殖。與傳統(tǒng)的腫瘤裂解物負(fù)載的DC疫苗相比,DRibbles負(fù)載的DC疫苗能顯著提高荷瘤小鼠生存率,抑制腫瘤生長。4.低濃度的DRibbles負(fù)載DC疫苗免疫小鼠即可有效的啟動(dòng)抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答,但過高濃度的DRibbles負(fù)載DC疫苗啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的效果欠佳。DRibbles負(fù)載DC疫苗加強(qiáng)免疫能有效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答,對(duì)小鼠抵御惡性腫瘤細(xì)胞的沖擊有顯著的免疫保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.85

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 王志勇,李聲偉,胡勤剛,田衛(wèi)東;口腔鱗癌中樹突狀細(xì)胞的免疫組化分析[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

2 李元棟;徐鈞;鄒浩軍;王春友;;1-MT Enhances Potency of Tumor Cell Lysate-pulsed Dendritic Cells against Pancreatic Adenocarcinoma by Downregulating the Percentage of Tregs[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2010年03期

3 韓偉;胡勤剛;王志勇;;樹狀細(xì)胞疫苗抑制腫瘤的實(shí)驗(yàn)觀察[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年02期

4 王輝;封芳;朱民高;王柔抒;王小平;吳穎;莊志祥;;自體腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療晚期腎癌的療效觀察[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年01期

，

本文編號(hào)：1301011