本文關鍵詞：小鼠DC體內遷移的示蹤及腫瘤DRibbles負載DC疫苗抗口腔鱗癌移植瘤的實驗研究

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【摘要】：背景：目前手術、放化療等傳統(tǒng)療法在進一步提高口腔鱗癌患者5年生存率方面進入了瓶頸期,因此免疫治療、基因治療、靶向治療等生物治療手段越來越受到臨床醫(yī)生和基礎研究者的關注。腫瘤免疫治療是腫瘤生物治療的主要手段之一,其目的是激發(fā)和增強機體自身免疫能力達到治療腫瘤。樹突狀細胞(Dendritic cell, DC)是機體內抗原遞呈能力最強的專職抗原提呈細胞,是免疫系統(tǒng)的樞紐。然而許多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者DC數(shù)量減少、功能和表型受損。因此體外制備腫瘤DC疫苗回輸給腫瘤患者成為研究熱點之一。腫瘤DC疫苗發(fā)揮抗腫瘤療效的關鍵在于DC疫苗能有效遷移到引流淋巴組織,遞呈腫瘤抗原給初始T細胞,啟動抗腫瘤免疫應答�；剌擠C在體內向淋巴組織的遷移效率是腫瘤DC疫苗啟動抗腫瘤免疫的關鍵因素。我們的前期研究中用合成的超順磁氧化鐵(Superparamagnetic iron oxide, SPIO)對DC進行標記示蹤,發(fā)現(xiàn)SPIO對DC有良好的生物相容性,但僅有少數(shù)標記后的DC在回輸后遷移到引流淋巴結。因此需要進一步研究SPIO對DC在體內遷移效率的影響,明確SPIO是否能夠作為臨床觀察DC疫苗遷移分布的示蹤劑。DC疫苗負載的抗原類型是腫瘤DC疫苗啟動抗腫瘤免疫的另一關鍵因素。目前腫瘤凍融裂解物(Lysate)負載DC法是最傳統(tǒng)的腫瘤全抗原負載DC的方法,但其療效尚不盡如人意。自噬是細胞普遍存在的降解受損或無用的大分子維持自穩(wěn)的生理過程。腫瘤細胞主要通過泛素化-蛋白酶體途徑和自噬-溶酶體途徑降解腫瘤抗原,而能被MHCI類分子直接遞呈的抗原肽主要來源于通過蛋白酶體降解的腫瘤抗原(尤其包括有缺陷的核糖體產物,即Defective ribosomal products, DRiPs)。通過自噬誘導劑、蛋白酶體抑制劑、溶酶體抑制劑處理腫瘤細胞,分離出的包含未降解的腫瘤全抗原(包括大量DRiPs)的小泡狀自噬體被稱為DRibbles (DRiPs in blebs),可作為新型腫瘤抗原。雖然DRibbles在多項研究中被證實是腫瘤抗原的有效攜帶者,但其中被交叉遞呈的腫瘤抗原成分的本質存在爭議。而口腔癌細胞系來源DRibbles是否能夠作為新型抗原提高DC疫苗對腫瘤的療效還需進一步研究。DRibbles負載DC疫苗誘導抗腫瘤免疫的機制以及DRibbles疫苗是否需要DC作為載體發(fā)揮抗腫瘤作用尚不明確。目的：1.觀察SPIO標記的小鼠DC在體內遷移及其效率。2.建立小鼠口腔鱗癌細胞系(SCC7)自噬性抗原(Dribbles)的制備方法并觀察其刺激T、B細胞增殖活化的作用。3.評價DRibbles對DC抗原遞呈功能的影響并觀察其負載DC疫苗對荷瘤C3H/HeJ小鼠的療效。4.評估DRibbles負載DC疫苗對惡性腫瘤細胞株沖擊遺傳背景相同小鼠的保護性免疫效果。方法：1.誘導培養(yǎng)小鼠骨髓來源DC,對其純度進行檢測。用不同濃度SPIO標記EGFP-DC,對細胞進行普魯士藍染色及平均含鐵量測定研究DC對SPIO攝取情況,流式細胞術檢測DC表面分子表達、凋亡比例、表達EGFP的熒光強度。不同濃度SPIO標記的EGFP-DC在小鼠足墊注射后24小時,用光學成像、免疫組化、流式細胞術檢測引流淋巴結EGFP熒光信號。SPIO標記的EGFP-DC及SPIO未標記的EGFP-DC對小鼠足墊注射后不同時間,用光學成像、免疫組化、流式細胞術檢測引流淋巴結EGFP熒光信號。2.小鼠口腔鱗癌細胞系SCC7誘導自噬不同時間,免疫印跡法檢測自噬標志分子LC3-Ⅱ的表達。SCC7誘導自噬24小時分離自噬性抗原DRibbles,用透射電鏡觀察其超微結構、掃描電鏡觀察其表面形態(tài)。SCC7反復凍融法制備Lysate。CCK-8法檢測不同濃度DRibbles刺激后脾臟細胞及淋巴結細胞的增殖活力；檢測DRibbles或Lysate刺激后脾臟細胞及淋巴結細胞的增殖活力。流式細胞術檢測不同濃度DRibbles刺激后脾臟細胞CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、Treg細胞比例；檢測DRibbles或Lysate刺激后脾臟及淋巴結B細胞表面標志的表達。不同劑量DRibbles經腹股溝淋巴結注射免疫小鼠7天后,對腹股溝淋巴結細胞計數(shù),流式細胞術檢測淋巴結CD4+IFN-γ+T細胞及CD8+IFN-γ+T細胞比例,ELISA檢測DRibbles再刺激后腹股溝淋巴結細胞和脾臟細胞培養(yǎng)上清的IFN-γ水平。3.激光共聚焦顯微鏡觀察DC對CFSE標記DRibbles的吞噬。流式細胞術檢測不同濃度DRibbles刺激后DC的凋亡比例；檢測DRibbles刺激不同時間后DC的凋亡比例；檢測DRibbles或Lysate刺激后DC的凋亡比例：檢測不同濃度DRibbles刺激后DC表面標志的表達；檢測DRibbles或Lysate刺激后DC表面標志的表達。用DRibbles或Lysate負載的DC進行混合淋巴細胞反應,CCK-8法檢測不同抗原負載的DC刺激后T細胞的增殖活力。DRibbles或Lysate負載的DC疫苗加強免疫荷瘤小鼠,對小鼠進行生存觀察和測量腫瘤大小。4.不同劑量DRibbles負載的DC疫苗加強免疫正常小鼠,流式細胞術檢測小鼠PBMC.脾臟細胞、腹股溝淋巴結細胞中CD4+IFN-γ+T細胞及CD8+IFN-γ+T細胞比例；免疫磁珠分選脾臟、淋巴結T細胞用于靶細胞殺傷實驗,檢測效應T細胞對SCC7的細胞毒性；ELISA檢測小鼠血漿及靶細胞殺傷實驗中的上清液IFN-γ水平。DRibbles、DRibble-DC、Lysate-DC、DC分別加強免疫小鼠后,用SCC7對小鼠進行沖擊,而后對小鼠進行生存觀察和測量腫瘤大��；流式細胞術檢測小鼠外周血單個核細胞(PBMC)及淋巴結細胞中Treg細胞比例；ELISA檢測淋巴結和脾臟細胞經DRibbles再刺激后培養(yǎng)上清IFN-γ水平。結果：1.誘導培養(yǎng)至第7天的小鼠骨髓來源DC中CD11c+細胞比例達80%以上。隨著SPIO標記濃度的提高,細胞內含鐵量逐漸增加,然而DC表面CD40、CD80、CD86、MHCII類分子、MHCI類分子的表達無顯著性變化,CCR7的表達逐漸降低(P＜0.05)；DC的凋亡比例無顯著改變；DC的EGFP熒光強度沒有顯著改變。DC回輸小鼠體內后24小時,隨著SPIO標記濃度的提高,DC遷移到初級引流淋巴結的效率逐漸降低。SPIO標記EGFP-DC組和未標記的EGFP-DC組在回輸后第7天時胭窩淋巴結EGFP+細胞最多,第14天EGFP+細胞減少,但兩組間無顯著性差異。在第4、7天SPIO標記EGFP-DC組腹股溝淋巴結能檢測到EGFP+細胞,而SPIO未標記的EGFP-DC組各時間點腹股溝淋巴結均未能檢測到EGFP+細胞。2.SCC7誘導自噬、抑制蛋白酶體活性和溶酶體活性24小時自噬標志分子LC3-Ⅱ的蛋白水平表達上調為對照組的2.82倍,且高于12小時組及顯著高于36小時組(P＜0.01)。DRibbles富含大量自噬體結構,直徑約200-900nm不等。10μg/ml DRibbles刺激淋巴細胞增殖作用在各濃度組中最強(P0.001)。DRibbles刺激淋巴細胞增殖作用顯著強于Lysate(P0.001)。10 μg/ml DRibbles刺激后脾臟T細胞比例上調達68.12%,顯著高于其他濃度組(P0.05)：其中CD4+細胞約占41.26%,CD8+細胞約占28.66%,均高于其他濃度組。DRibbles比Lysate更能顯著下調脾臟細胞Treg細胞比例至1.08%(P0.01)。DRibbles比Lysate更能顯著上調B細胞表面CD40、CD80、CD86、MHCII類分子的表達(P 0.05)。2.5μg DRibbles經淋巴結注射免疫的小鼠淋巴結細胞CD4+IFN-γ+T細胞比例增加至1.16%,CD8+IFN-γ+T細胞比例增加至0.53%,淋巴結細胞和脾臟細胞再刺激后分泌IFN-γ分別高達1086.45 pg/ml和142.04 pg/ml,均高于其他劑量免疫組。3.共孵育6小時即可觀察到大部分DC吞噬了CFSE標記的DRibbles。不同濃度DRibbles和其不同刺激時間對DC凋亡無顯著性影響(PO.05)。DRibbles及Lysate負載DC對其凋亡則無組間顯著性差異(P0.05)。不同濃度DRibbles能顯著上調DC表面CD40、CD86、MHCI類分子的表達水平,表達陽性的細胞比例隨著DRibbles濃度的加大而逐漸增加。不同濃度DRibbles刺激DC后MHCⅡ類分子的表達則無顯著性變化(P0.05)。與Lysate組和對照組相比,DRibbles負載的DC表達CD40、CD86、MHC I類分子顯著上調(P0.05),而MHCⅡ類分子在各組中的表達無顯著差異(P0.05)。DRibble-DC比Lysate-DC具有更強的在體外刺激T細胞增殖的能力(P0.05),且加入促成熟因子后這種差異更加顯著(P0.01)。與Lysate-DC及對照組相比,DRibble-DC能顯著提高荷瘤小鼠生存率至87.5%,抑制腫瘤生長。4.以2.5μg/ml DRibbles負載的DC疫苗免疫組小鼠脾臟來源T細胞及淋巴結來源T細胞對SCC7的細胞毒性分別高達52.85%和66.14%,均高于其他濃度負載組；血漿IFN-γ水平為7.04 pg/ml,脾臟細胞T細胞及淋巴結T細胞再刺激后上清IFN-γ水平分別為7.59 pg/ml和13.89 pg/ml,均高于其他濃度負載組；PBMC中CD8+IFN-γ+T細胞達3.68%,CD4+IFN-γ+細胞占T細胞的比例達7.35%,脾臟中CD4+IFN-γ+細胞占T細胞的比例達2.19%,淋巴結中CD8+IFN-γ+細胞占T細胞的比例達2.38%,CD4+IFN-γ+田胞占T細胞的比例達5.44%,均高于其他濃度負載組。DRibbles負載的DC疫苗能顯著提高腫瘤沖擊后小鼠的生存率至90%(P＜0.05),抑制腫瘤生長(P＜0.05),降低PBMC及淋巴結中Treg細胞比例分別至7.04%和8.31%。DRibbles負載的DC疫苗免疫組小鼠淋巴結細胞、脾臟細胞用DRibbles再刺激后分泌工FN-γ,水平分別為862.9 pg/ml和309.5 pg/ml,顯著高于其他疫苗免疫組(P0.05)。結論：1.不同濃度SPIO標記的DC,盡管其含鐵量不同,但其表面CD40、CD80、CD86、 MHC Ⅱ、MHC Ⅰ類分子的表達水平尚未見到明顯改變,細胞凋亡也無顯著差異。雖然從短期(24小時)觀察來看,隨著SPIO標記濃度的升高,DC表達CCR7比例和遷移到初級引流淋巴結的數(shù)量逐漸減少,但從長期(14天)觀察來看,SPIO標記的DC與未標記DC遷移到初級引流淋巴結的數(shù)量無顯著差異,而SPIO標記的DC遷移到次級引流淋巴結的數(shù)量則顯著高于未標記DC。SPIO標記的DC與未標記DC均在第7天遷移到初級引流淋巴結的數(shù)量最多,到第14天數(shù)量顯著減少。2.建立了小鼠口腔鱗癌細胞系來源DRibbles的制備方法,誘導分離獲得的DRibbles富含自噬體。DRibbles作為新型腫瘤抗原,在體外能夠刺激淋巴細胞增殖活化,減少抑制性T細胞的比例。DRibbles在低劑量下直接免疫小鼠就能有效誘導細胞免疫反應,但過高劑量的DRibbles直接免疫小鼠誘導的細胞免疫反應強度反而不及低劑量組。3.DRibbles以不同濃度及不同時間刺激DC對其凋亡無顯著影響。DRibbles能顯著上調DC表面CD40、CD86、MHC Ⅰ類分子的表達,上調程度呈劑量依賴性,對MHCⅡ類分子的表達無顯著影響。DRibbles比傳統(tǒng)腫瘤凍融裂解抗原更能促進DC遞呈抗原,刺激T細胞增殖。與傳統(tǒng)的腫瘤裂解物負載的DC疫苗相比,DRibbles負載的DC疫苗能顯著提高荷瘤小鼠生存率,抑制腫瘤生長。4.低濃度的DRibbles負載DC疫苗免疫小鼠即可有效的啟動抗腫瘤細胞免疫應答,但過高濃度的DRibbles負載DC疫苗啟動抗腫瘤免疫應答的效果欠佳。DRibbles負載DC疫苗加強免疫能有效誘導抗腫瘤免疫應答,對小鼠抵御惡性腫瘤細胞的沖擊有顯著的免疫保護作用。
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.85

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 王志勇,李聲偉,胡勤剛,田衛(wèi)東;口腔鱗癌中樹突狀細胞的免疫組化分析[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2004年02期

2 李元棟;徐鈞;鄒浩軍;王春友;;1-MT Enhances Potency of Tumor Cell Lysate-pulsed Dendritic Cells against Pancreatic Adenocarcinoma by Downregulating the Percentage of Tregs[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2010年03期

3 韓偉;胡勤剛;王志勇;;樹狀細胞疫苗抑制腫瘤的實驗觀察[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2006年02期

4 王輝;封芳;朱民高;王柔抒;王小平;吳穎;莊志祥;;自體腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞治療晚期腎癌的療效觀察[J];細胞與分子免疫學雜志;2015年01期

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本文編號：1301010