本文關(guān)鍵詞：硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sialin在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的初步探究

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【摘要】：目的:建立血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型,模擬血管缺血再灌注損傷過程,研究硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sialin在組織缺血再灌注損傷中的表達(dá)變化,初步研究缺氧復(fù)氧損傷與Sialin的相關(guān)性,并初步探討硝酸鹽對(duì)細(xì)胞的作用,為臨床上預(yù)防和治療組織瓣缺血再灌注損傷提供新思路。材料和方法:第一部分:建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)缺氧復(fù)氧模型,模擬血管缺血再灌注損傷過程。將HUVEC根據(jù)不同缺氧時(shí)間分為四組:正常對(duì)照組(Control組);缺氧3h/復(fù)氧2h組(3h/2h組);缺氧6h/復(fù)氧2h組(6h/2h組);缺氧9h/復(fù)氧2h組(9h/2h組)。細(xì)胞缺氧過程中換用低糖DMEM無血清培養(yǎng)基,使用厭氧細(xì)胞培養(yǎng)盒進(jìn)行細(xì)胞缺氧培養(yǎng),完成后換用原培養(yǎng)基,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目,CCK-8測(cè)定細(xì)胞活性,Annexin V-PI染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。評(píng)價(jià)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的有效性。第二部分:Sialin在HUVEC缺氧復(fù)氧模型中表達(dá)變化的研究。RT-PCR、Western Blot、免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察Sialin在HUVEC細(xì)胞上的表達(dá)及定位;Real-time PCR及Western Blot分別檢測(cè)Sialin基因及蛋白的表達(dá)水平變化;第三部分:硝酸鹽對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的初步探究。細(xì)胞外加載30mmol/L硝酸鈉,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡情況,初步探討硝酸鹽對(duì)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用。結(jié)果:1.HUVEC缺氧復(fù)氧模型實(shí)驗(yàn),顯微鏡下觀察:隨缺氧時(shí)間增加,死細(xì)胞數(shù)量增加,細(xì)胞密度明顯減低;臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn):活細(xì)胞比例隨缺氧時(shí)間增加明顯下降(P0.05);CCK-8實(shí)驗(yàn):各實(shí)驗(yàn)組隨缺氧時(shí)間增加細(xì)胞活性明顯降低(P0.05);細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):隨缺氧時(shí)間增加,細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡比例均明顯上升(P0.05),活細(xì)胞比例顯著下降(P0.05)。結(jié)果證明,各組細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷程度加重。RT-PCR、Western Blot實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了Sialin蛋白在HUVEC細(xì)胞膜上及胞質(zhì)內(nèi)有較高水平表達(dá);Real-time PCR、Western Blot實(shí)驗(yàn)證明HUVEC中Sialin表達(dá)水平隨缺氧時(shí)間增加而顯著下降(P0.05)。2.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及CCK-8實(shí)驗(yàn),證明常氧及缺氧復(fù)氧條件下,細(xì)胞外加載濃度為30 mmol/L的硝酸鈉,細(xì)胞活性較對(duì)照組均明顯降低(P0.05),且早期凋亡和晚期凋亡比例較Control組明顯上升(P0.05),正常細(xì)胞比例明顯下降(P0.05);而在缺氧復(fù)氧條件下,細(xì)胞外加載硝酸鈉,CCK-8的OD變化值及凋亡實(shí)驗(yàn)中正常細(xì)胞比例的變化值均較常氧條件下明顯降低(P0.05);此外,鏡下形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)加載硝酸鹽組細(xì)胞在缺氧3h后即刻,形態(tài)發(fā)生明顯變化,呈長梭形,有管腔樣結(jié)構(gòu)形成,復(fù)氧后,形態(tài)恢復(fù)。結(jié)論:1.使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,建立了血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷模型;隨著缺氧時(shí)間延長,細(xì)胞活力降低,細(xì)胞凋亡增加;2.證明了Sialin在HUVEC細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)上有較高表達(dá),且隨缺氧損傷加重,Sialin表達(dá)水平下降;3.常氧條件下,細(xì)胞外加載高濃度硝酸鹽,有明顯的細(xì)胞毒性作用;缺氧復(fù)氧條件下,細(xì)胞外加載高濃度硝酸鹽,細(xì)胞毒性作用明顯下降,提示缺氧后硝酸鹽對(duì)細(xì)胞作用可能發(fā)生改變。
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782

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1 牛其芳;硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sialin在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的初步探究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2016年

2 郎娟;IL-1β對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的促血管生成作用研究[D];杭州師范大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：1293374