本文關(guān)鍵詞：PERK通路在炎癥微環(huán)境影響牙周膜干細(xì)胞成骨分化中作用的研究

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【摘要】：慢性牙周炎是我國(guó)乃至世界性高發(fā)的口腔感染類(lèi)疾病,牙槽骨的不可逆性吸收是牙周炎療效不佳的重要瓶頸。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一類(lèi)位于牙周膜(periodontal ligament,PDL)組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),在體外有良好的成骨和成牙骨質(zhì)能力。而在牙周炎癥環(huán)境中,PDLSCs的成骨能力明顯降低,無(wú)法成功修復(fù)炎癥牙周組織中的骨缺損。目前對(duì)炎癥微環(huán)境改變PDLSCs成骨能力的機(jī)制研究多數(shù)著眼于各種信號(hào)通路和分子上,但僅調(diào)控其中某些因子無(wú)法達(dá)到有效的治療效果,因此,找到這些因子上游細(xì)胞器水平的相關(guān)調(diào)控機(jī)制將具有更強(qiáng)的可操作性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是細(xì)胞的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng),通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有保護(hù)效果,而過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則有破壞作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR已被證實(shí)參與了多種慢性炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展,亦被證明與牙周炎癥有關(guān)。同時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR特別是雙聯(lián)RNA激活蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase(PKR)like endoplasmic reticulum kinase,PERK)通路參與了間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程。然而,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR是否參與了炎癥微環(huán)境中PDLSCs成骨能力改變尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。研究目的:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及UPR的PERK通路在炎癥微環(huán)境抑制PDLSCs成骨能力中的作用,為牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù),為牙周炎的治療提供可能靶點(diǎn)。研究方法:1.從臨床上選取符合條件的健康牙齒及牙周炎患牙,分別隨機(jī)分成3組,以健康牙作為對(duì)照。一組脫鈣后制作石蠟切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色確定牙周組織完整的切片部位,繼而對(duì)相應(yīng)連續(xù)切片免疫組織化學(xué)染色,檢測(cè)PERK通路相關(guān)因子糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、PERK、活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor,ATF4)和轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(transcription factor C/EBP homologous protein,CHOP)的定位表達(dá)情況;刮取牙根中1/3部位根面牙周膜或殘留牙周膜及炎性肉芽組織,一組經(jīng)組織勻漿后行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR),一組行組織蛋白裂解后使用蛋白印跡法(Western blot),分別檢測(cè)PERK通路相關(guān)因子的基因和蛋白的定量表達(dá)情況。2.從臨床上選取健康的牙齒,使用酶組織塊消化法,從根中1/3部位根面牙周膜組織中在體外分離培養(yǎng)出PDLSCs,使用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞純化,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞克隆形成能力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞MSCs特異性表面標(biāo)記物驗(yàn)證細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞特性,成骨和成脂誘導(dǎo)檢測(cè)細(xì)胞多向分化能力,以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑衣霉素(tunicamycin,TM)和毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)對(duì)PDLSCs刺激,以未經(jīng)激活劑刺激的PDLSCs作為對(duì)照,行q RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6 h、9 h和12 h)PERK通路相關(guān)因子在PDLSCs中的基因表達(dá)水平;同時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過(guò)q RT-PCR和Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)因子堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的基因表達(dá)以及Runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)的基因和蛋白表達(dá)水平,通過(guò)ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成能力。3.使用梯度濃度(1 ng/ml、10 ng/ml和20 ng/ml)的炎性因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)模擬炎癥環(huán)境,對(duì)PDLSCs進(jìn)行刺激,以未經(jīng)TNF-α刺激的PDLSCs作為對(duì)照,通過(guò)q RT-PCR和Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(6 h、12 h、24 h和72 h)PDLSCs中PERK通路相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)水平;同時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過(guò)q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞的成骨能力。從而篩選出合適的TNF-α刺激濃度及作用時(shí)長(zhǎng)。4.用梯度濃度(0.5 m M、1 m M、2.5 m M、5 m M和7.5 m M)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)處理PDLSCs,使用CCK-8檢測(cè)12 h和24 h時(shí)細(xì)胞的增殖情況以測(cè)試4-PBA的細(xì)胞毒性,確定其合適的預(yù)處理時(shí)間。使用梯度濃度的4-PBA預(yù)處理PDLSCs后,用篩選出的TNF-α濃度刺激細(xì)胞,以未經(jīng)4-PBA預(yù)處理僅由TNF-α刺激的PDLSCs作為對(duì)照,通過(guò)q RT-PCR和Western blot檢測(cè)PDLSCs中PERK通路相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)水平;同時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過(guò)q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞的成骨能力。5.用PERK小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)對(duì)PDLSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染,以?xún)H導(dǎo)入脂質(zhì)體的空載細(xì)胞作為對(duì)照,檢測(cè)PERK的基因轉(zhuǎn)染效率和蛋白抑制率。轉(zhuǎn)染48 h后,使用10 ng/ml的TNF-α刺激細(xì)胞12 h,以經(jīng)TNF-α刺激的空載PDLSCs作為對(duì)照,通過(guò)q RT-PCR和Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)PDLSCs中PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白表達(dá)水平;同時(shí)進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過(guò)q RT-PCR、Western blot、ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞的成骨能力。研究結(jié)果:1.在牙周炎患牙的炎性牙周膜和肉芽組織中,PERK通路相關(guān)因子GRP78、PERK、ATF4和CHOP的免疫組化染色陽(yáng)性率、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)與健康牙周膜組織相比明顯升高。2.從健康牙周膜組織中可成功分離培養(yǎng)出牙周膜干細(xì)胞,純化后,其形態(tài)呈長(zhǎng)梭狀,呈克隆化生長(zhǎng),陽(yáng)性表達(dá)CD146、CD105、CD90和CD44等MSCs特異性表面標(biāo)記物,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31和造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34,具有良好的成骨和成脂分化能力。PDLSCs經(jīng)1μg/ml TM刺激6 h和9 h后,PERK通路相關(guān)因子的m RNA表達(dá)較未刺激組均明顯上升,12 h時(shí)各因子表達(dá)出現(xiàn)明顯回落;經(jīng)0.1μM TG刺激后,GRP78、PERK和ATF4的m RNA均僅在9 h時(shí)較未刺激組明顯升高,CHOP的m RNA在9 h和12 h均明顯升高。TM組與TG組9 h時(shí)相比,PERK通路各因子的表達(dá)量明顯升高。成骨誘導(dǎo)后,經(jīng)TM或TG刺激的PDLSCs的ALP基因表達(dá)及活性、Runx2和OCN的基因和蛋白表達(dá)以及礦化結(jié)節(jié)形成能力均較未刺激組明顯降低,且TM組低于TG組。3.刺激PDLSCs 12 h時(shí),三種濃度的TNF-α均使PERK通路相關(guān)因子的基因和蛋白表達(dá)明顯升高并達(dá)到峰值,1 ng/ml的TNF-α對(duì)PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白激活能力相對(duì)較弱。在72 h時(shí),10 ng/ml TNF-α組ATF4的表達(dá)量和PERK的蛋白水平比20 ng/ml組更高。成骨誘導(dǎo)后,3種濃度的TNF-α均可抑制ALP基因表達(dá)及活性、Runx2和OCN的基因和蛋白表達(dá)以及礦化結(jié)節(jié)形成能力,其中10 ng/ml和20 ng/ml的TNF-α對(duì)細(xì)胞ALP活性、Runx2的基因表達(dá)、OCN的基因和蛋白水平以及礦化結(jié)節(jié)形成的抑制能力高于1 ng/ml的TNF-α。由此確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取濃度為10ng/ml的TNF-α來(lái)模擬炎癥環(huán)境,并在刺激12 h時(shí)對(duì)PERK通路相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)。4.濃度為7.5 m M的4-PBA對(duì)PDLSCs預(yù)處理24 h時(shí),細(xì)胞增殖水平明顯下降,體現(xiàn)出細(xì)胞毒性。經(jīng)梯度濃度4-PBA預(yù)處理12 h后使用TNF-α刺激PDLSCs 12 h,結(jié)果顯示較低濃度的4-PBA(0.5、1和2.5 m M)較未預(yù)處理對(duì)照組可有效抑制PERK通路相關(guān)因子的m RNA表達(dá)和GRP78、PERK及ATF4的蛋白水平,且三者間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而7.5 m M的4-PBA僅能抑制CHOP的m RNA表達(dá),卻提高了PERK的m RNA及蛋白表達(dá)和ATF4的蛋白水平。成骨誘導(dǎo)后,較低濃度的4-PBA較未預(yù)處理對(duì)照組可有效提升ALP基因表達(dá)、Runx2的基因和蛋白表達(dá)、OCN的蛋白水平以及礦化結(jié)節(jié)能力,1 m M和2.5 m M的4-PBA還可使OCN的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。7.5 m M的4-PBA卻抑制了Runx2的基因和蛋白、OCN的蛋白表達(dá)和細(xì)胞ALP活性。5.轉(zhuǎn)染PERK si RNA的PERK基因抑制效率為56%,蛋白表達(dá)抑制效率為52%。PERK未被沉默時(shí),TNF-α可使PERK、ATF4和CHOP的基因和蛋白表達(dá)較未刺激對(duì)照組明顯上升,而PERK被沉默后,即使被TNF-α刺激12 h,3種基因和蛋白表達(dá)仍然明顯回落。成骨誘導(dǎo)后,空載的PDLSCs經(jīng)TNF-α持續(xù)刺激后,成骨能力較未經(jīng)TNF-α刺激對(duì)照組均明顯下降,而在PERK基因沉默后由TNF-α刺激PDLSCs,其成骨能力較空載組明顯回升。結(jié)論:1.在牙周炎患牙的炎癥牙周膜及肉芽組織中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和PERK通路處于激活狀態(tài);2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑可有效激活PDLSCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和PERK通路并抑制細(xì)胞的成骨能力;3.在慢性炎癥微環(huán)境中,TNF-α可通過(guò)激活細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和PERK通路來(lái)抑制PDLSCs的成骨能力,該作用可被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA或PERK沉默而逆轉(zhuǎn)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R781.4

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1 毛釗;影響牙周膜細(xì)胞生物學(xué)功能的相關(guān)因素[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2003年06期

2 凌均h，

本文編號(hào)：1293286