本文關(guān)鍵詞：P物質(zhì)加載自固化磷酸鈣復(fù)合材料誘導(dǎo)BMSCs分化的體外研究

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【摘要】：目的:由炎癥、創(chuàng)傷等各種原因?qū)е碌难啦酃侨睋p、缺失在臨床上十分常見,對患者口腔的功能和美觀均可造成嚴(yán)重的影響,利用再生醫(yī)學(xué)和組織工程理論與技術(shù)構(gòu)建牙槽骨修復(fù)重建材料是解決這些問題的重要方向。自固化磷酸鈣(CPC)也被稱為骨水泥,是具有良好生物相容性的植骨替代材料,能夠調(diào)拌為糊劑隨意塑形并自行固化,具有一定機(jī)械力學(xué)強(qiáng)度和骨引導(dǎo)性能,適合于復(fù)雜外形骨缺損的填充,但CPC在體內(nèi)的降解速度緩慢,沒有誘導(dǎo)骨再生的生物活性,填充骨缺損后難以早期轉(zhuǎn)化為骨組織,不能滿足牙槽外科修復(fù)重建的臨床要求。本研究探索通過加載人工合成神經(jīng)多肽P物質(zhì)(SP)于CPC材料,并復(fù)合I型膠原,制備以磷酸鈣為基礎(chǔ)的復(fù)合材料支架,通過體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),觀察材料誘導(dǎo)BMSCs增殖分化的作用,為進(jìn)一步構(gòu)建適用于復(fù)雜牙槽骨缺損修復(fù)的自固化組織工程材料提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1、材料準(zhǔn)備:購買臨床用自固化磷酸鈣材料,人工多肽合成儀合成P物質(zhì),鼠尾腱提取3%I型膠原溶液,分為3組制備復(fù)合材料支架。A組為純CPC組;B組為CPC+I型膠原組;C組為CPC+I型膠原+P物質(zhì)組。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察支架樣本表面形貌。2、SD大鼠BMSCs培養(yǎng)和鑒定:4周齡雌性大鼠,經(jīng)深度麻醉后脫頸處死,解剖股骨及脛骨,去凈軟組織后切除干骺端,PBS緩沖液沖出骨髓,經(jīng)離心后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶內(nèi),加入α-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔天PBS沖洗并更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),之后每2天換液1次。通過測定細(xì)胞增殖對數(shù)、成骨及成脂誘導(dǎo)對BMSCs進(jìn)行鑒定。3、P物質(zhì)對BMSCs生物學(xué)行為的影響:原代BMSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)至P4代,接種于96孔板,隨機(jī)分為2組,實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液加入P物質(zhì),分別測定1,3,5,6,7天細(xì)胞增殖對數(shù),并繪圖比較兩組差異。4、各組材料對BMSCs生物學(xué)行為的影響:原代BMSCs經(jīng)傳代培養(yǎng)至P4代,分別接種于各組材料表面,SEM觀察BMSCs的形態(tài)、粘附與增殖,熒光染色定量分析BMSCs的粘附與增殖,ALP試劑盒檢測細(xì)胞ALP活性,茜素紅染色鈣沉積物,比較BMSCs的成骨分化。結(jié)果:1、材料合成:A、B、C三組材料在SEM下觀察表面形貌,可見A組材料表面大量納米級磷灰石結(jié)晶結(jié)構(gòu),孔隙直徑一般為50微米以下;B、C兩組材料可見膠原與CPC聯(lián)結(jié)緊密,被覆于磷灰石結(jié)晶表面,材料孔隙較大,條索狀,可達(dá)50微米以上。2、SD大鼠BMSCs培養(yǎng)和鑒定:原代BMSCs生長旺盛,生長曲線復(fù)合典型“S”形,培養(yǎng)3天約占瓶底50%,5天約占瓶底70%,7天即可傳代培養(yǎng)。分別經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)3周,行茜素紅和油紅O染色,光學(xué)倒置顯微鏡下分別可見鈣化結(jié)節(jié)及脂滴形成,BMSCs多向分化能力良好。3、P物質(zhì)對BMSCs生物學(xué)行為的影響:96孔板內(nèi)細(xì)胞經(jīng)測定1,3,5,6,7天的BMSCs增殖對數(shù),實(shí)驗(yàn)組(加入P物質(zhì))BMSCs增殖顯著優(yōu)于對照組(P0.05)。4、各組材料對BMSCs生物學(xué)行為的影響:SEM下觀察,A組表面BMSCs粘附數(shù)量少于B、C組,A組表面BMSCs細(xì)胞多呈梭形,細(xì)胞突觸較短;B、C組表面BMSCs細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形、星型,特別在膠原表面細(xì)胞數(shù)量多,突觸長并彼此相聯(lián),細(xì)胞伸展良好。熒光染色后,經(jīng)熒光顯微鏡下觀察,A、B、C三組材料表面1,7,14天BMSCs活細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,14天時已基本鋪滿,死或凋亡細(xì)胞比例逐漸減少,C組活細(xì)胞比例略高于A、B兩組。成骨誘導(dǎo)14天后茜素紅染色,肉眼觀C組顏色較深,ALP檢測C組BMSCs的ALP表達(dá)高于A、B兩組。結(jié)論:CPC復(fù)合膠原成分并加載P物質(zhì)制備的復(fù)合材料支架,對大鼠BMSCs的粘附、增殖均具有促進(jìn)作用,BMSCs的成骨分化、ALP表達(dá)等顯著提高,無細(xì)胞毒性,是一種具有良好應(yīng)用前景的自固化骨再生誘導(dǎo)組織工程材料。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R782
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本文編號：1260360