本文關(guān)鍵詞：牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP代謝相關(guān)基因的克隆及表達(dá)純化

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【摘要】：目的克隆牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)中負(fù)責(zé)c-di-AMP代謝的相關(guān)基因,并使其在大腸桿菌中正確表達(dá)及高效純化。方法通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆牙齦卟啉單胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三個(gè)基因,經(jīng)過酶切后將目的基因片段與大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒p ET28a連接,分別構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒p ETpgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析和鑒定。用鎳離子金屬親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化,BCA法檢測(cè)目的蛋白的濃度。結(jié)果目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003擴(kuò)增產(chǎn)物條帶與預(yù)期大小一致。重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-pgn0523、p ET-pgn1187和p ET-pgn2003及其PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證與預(yù)期大小相符,測(cè)序結(jié)果與Gen Bank中牙齦卟啉單胞菌ATCC33277國際標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列100%一致。IPTG誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)得到3個(gè)大小分別為19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白質(zhì)增強(qiáng)條帶,與預(yù)期大小相符。鎳離子金屬親和層析柱純化得到的蛋白與預(yù)期目的蛋白分子量一致,BCA法測(cè)定目的蛋白的濃度分別為0.708、0.523和0.861 mg·m L-1。結(jié)論本研究成功克隆并表達(dá)純化了牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP代謝相關(guān)蛋白,得到了較高濃度和純度的目的蛋白,為進(jìn)一步探究牙齦卟啉單胞菌c-di-AMP的生理功能及體內(nèi)代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華西口腔醫(yī)院(四川大學(xué));
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200985)
【分類號(hào)】：R780.2
【正文快照】： c-di-AMP[1]是近些年繼c AMP、c-di-GMP后新發(fā)現(xiàn)的一種在細(xì)菌和支原體中廣泛存在的環(huán)核苷酸第二信使分子,這些細(xì)菌包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[1-3]、單核增生李斯特菌(Listeria monocy-togenes)[4-6]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus au-reus)[7]、肺炎鏈球菌(Strept

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