本文關(guān)鍵詞：變形鏈球菌耐氟菌株及其親代菌株耐酸groE操縱子甲基化差異的比較

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【摘要】：目的:齲病是以細(xì)菌感染為主,多種因素共同作用引起的牙體硬組織疾病。齲病慢性進(jìn)行性發(fā)展,破壞牙體硬組織,會造成牙體組織在色、形、質(zhì)等方面的改變,該過程不可逆。齲病是常見多發(fā)的口腔疾病,早在上世紀(jì)七十年代,就被世界衛(wèi)生組織列為嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一。在多種齲病致病菌中,變形鏈球菌的致病性最強(qiáng)[1-3],所以學(xué)者們對齲病的研究多圍繞變形鏈球菌展開。近年來,氟化物防齲取得了較好的臨床效果,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床,這種做法的弊端是導(dǎo)致了耐氟菌株的選擇性生長[4]。目前,學(xué)者對變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關(guān)基因ffh、dfp、dlt C、dnaK[5-7]等都已進(jìn)行了基因突變位點的檢測,并且運(yùn)用氟化物成功的誘導(dǎo)出耐氟突變菌株[8]。耐氟菌株產(chǎn)酸和耐酸的能力均強(qiáng)于親代菌株,導(dǎo)致了突變菌株致齲性增強(qiáng)[9-10],這與耐酸基因的突變有一定的關(guān)聯(lián)。DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象,它是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化的一種基因修飾,將S腺苷甲硫氨酸的甲基置換到DNA分子中的堿基上。大量研究顯示,DNA甲基化能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變,從而調(diào)控基因的表達(dá)[11]。這種DNA修飾的方式并沒有改變基因的堿基序列,但是由此調(diào)控了基因的表達(dá)[12]。目前,變形鏈球菌UA159及其耐氟菌株UA159-FR全基因組序列已提交至Genbank數(shù)據(jù)庫,登錄號分別為AE014133[13]、CP007016[14]。結(jié)果顯示groEL-groES無堿基突變。在酸應(yīng)激時,groEL-groES受到激發(fā),GroEL分子伴侶表達(dá),輔助蛋白質(zhì)的組裝、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解,增強(qiáng)了對酸的適應(yīng)性,這與基因突變不相關(guān),但與基因表觀遺傳學(xué)修飾——基因甲基化水品是否相關(guān)仍不清楚。本實驗通過檢測變形鏈球菌耐氟菌株與其親代菌株基因甲基化水平是否改變,進(jìn)一步揭示變形鏈球菌耐氟菌株的致齲機(jī)制,為氟化物防齲的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法:1.利用氟化物誘導(dǎo)變形鏈球菌耐氟菌株(S.mutans UA159-FR)。2.變形鏈球菌(s.mutansua159)及其耐氟菌株(s.mutansua159-fr)的培養(yǎng)。3.s.mutansua159-fr16srdna菌種鑒定。4.s.mutansua159及s.mutansua159-fr全基因組提取。5.s.mutansua159-fr目的基因groel-groespcr擴(kuò)增。6.構(gòu)建重組質(zhì)粒:s.mutansua159-fr目的基因groel-groes的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與pmd-18t載體進(jìn)行ta連接,并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α中擴(kuò)增。7.裂解感受態(tài)大腸桿菌,提取重組質(zhì)粒,用pstⅠ及hindⅢ雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定。8.s.mutansua159-fr目的基因groel-groes送檢測序。9.s.mutansua159及s.mutansua159-fr全基因組送檢,groel-groes基因甲基化檢測,比較兩者甲基化水平的差異。結(jié)果:1.成功的誘導(dǎo)并培養(yǎng)了變形鏈球菌耐氟菌株(s.mutansua159-fr)。2.菌種s.mutansua159及s.mutansua159-fr16srdna菌種鑒定成功。3.目的基因groel-groes與pmd18-t載體連接成功,構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒,并實現(xiàn)重組質(zhì)粒在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α中的擴(kuò)增。4.完成基因測序,將結(jié)果與genbank上公布的s.mutansua159目的基因groel-groes序列進(jìn)行blast比對,發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌耐氟菌株目的基因groel-groes與親代基因序列完全相同,無突變發(fā)生。5.完成目的基因的甲基化檢測,結(jié)果顯示變形鏈球菌耐氟菌株groel-groes甲基化水平與親代基因甲基化水平相當(dāng),不存在明顯差異。結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關(guān)基因groel-groes重組質(zhì)粒,并進(jìn)行菌種鑒定、基因測序及變形鏈球菌耐氟菌株與親代菌株基因甲基化水平檢測,發(fā)現(xiàn)變形鏈球菌耐氟菌株與其親代菌株相比基因未發(fā)生突變,并且基因甲基化水平未發(fā)生變化,變形鏈球菌耐氟菌株耐酸性增強(qiáng)與其耐酸相關(guān)基因groel-groes的基因突變和甲基化水平無明顯的聯(lián)系,為進(jìn)一步揭示變形鏈球菌耐氟菌株的致齲機(jī)制提供理論依據(jù),對氟化物防齲的臨床應(yīng)用有指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.1

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1 牛雪微;變形鏈球菌耐氟菌株及其親代菌株耐酸groE操縱子甲基化差異的比較[D];吉林大學(xué);2016年

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本文編號：1258094