本文關(guān)鍵詞：非綜合征唇腭裂的MSX1和IRF6基因突變研究

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【摘要】：研究目的先天性唇腭裂(orofacial cleft, OFC)是口腔臨床最常見的先天發(fā)育缺陷,其發(fā)病率大約為千分之一至千分之二。唇腭裂患者都存在面部美觀、功能甚至心理等一系列問題,這些患者往往需要序列治療,包括外科手術(shù)、口腔正畸、語言訓練及心理治療等,由此產(chǎn)生了一系列家庭及社會問題。因此,研究唇腭裂的病因機制,不僅有助于從根本上理解唇腭裂的發(fā)生和發(fā)展過程,也能給臨床的病因診斷及遺傳咨詢帶來巨大的幫助,有著很重大的社會意義。根據(jù)是否合并其他器官的改變,唇腭裂可分為綜合征唇腭裂(syndromic cleft lip with or without cleft palate, SCL/P)及非綜合征性唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL/P)兩種。非綜合征性唇腭裂占唇腭裂總數(shù)的70%,包括單純唇裂(cleft lip, CL)、單純腭裂(cleft palate, CP)、唇裂伴腭裂(cleft lip and palate, CLP)。綜合征唇腭裂的致病基因往往比較明確,大多為單基因遺傳病,而非綜合征唇腭裂的致病因素相對復雜,研究非綜合征唇腭裂可以更好的理解唇腭裂的發(fā)病機制。本研究是對山東地區(qū)非綜合征唇腭裂患者進行收集,采樣,并從外周血白細胞中提取基因組DNA,利用分子遺傳學技術(shù),對臨床收集的非綜合征唇腭裂患者進行MSXl基因和IRF6基因突變檢測,尋找MSXl基因和IRF6基因突變攜帶者,進行突變基因型的生物信息學分析,探索MSXl基因和IRF6基因突變與非綜合征唇腭裂的關(guān)系。研究方法首先進行病例和對照人群的資料和DNA收集。收集臨床病例標準：2013-2015年,在山東大學第二醫(yī)院進行唇腭裂治療的患者,選擇符合以下條件者：1)唇腭裂患者；2)不伴發(fā)其他系統(tǒng)器官畸形。在患者或監(jiān)護人知情同意的基礎(chǔ)上,納入作為研究對象。收集正常對照選取標準：1)無唇腭裂病史；2)其他器官無發(fā)育異常。在本人或監(jiān)護人知情同意的基礎(chǔ)上,納入本研究。實驗內(nèi)容包括：1)抽取患者及部分家系成員的外周靜脈血2m1/人,另抽取正常人外周靜脈血208份。EDTA抗凝,-70℃保存?zhèn)溆谩２捎萌蚪MDNA試劑盒提取基因組DNA；2)聚合酶鏈式反應(yīng)擴增MSXl和IRF6基因的全部外顯子區(qū)域,將產(chǎn)物直接進行測序；3)從NCBI-Homologene數(shù)據(jù)庫中提取人MSX1和IRF6蛋白的同源序列,將人MSX1蛋白(NP 002439.2)和9種脊椎動物的Msx1蛋白(NP_001182191.1, XP_001118871.2, XP_545946.2, NP_777223.1, NP_034965.2, NP_112321.1, NP_990819.1, NP_571348.1 NP_001032329.1)進行比對,從NCBI-Homologene數(shù)據(jù)庫中提取人IRF6蛋白的同源序列。將人IRF6蛋白(NP 006138.1)和9種脊椎動物的Irf6蛋白(XP_514168.2, XP_001110321.1, XP_005622392.1, NP_001070402.1, NP_058547.2, NP_001102329.1, XP_417990.4, NP_956892.1和NP 001025493.1)進行比對,利用ClustalW2軟件分析氨基酸的保守性；4)從NCB I-Homologene數(shù)據(jù)庫中提取人MSX1蛋白的同源序列,運用ClustalX2.0.12程序?qū)@些蛋白序列進行了多重比較,并且利用PsiPred 3.0程序?qū)θ薓SX1的2D結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；從NCBI-Homologene數(shù)據(jù)庫中提取人IRF6蛋白的同源序列。運用ClustalX2.0.12程序?qū)@些蛋白序列進行了多重比較,并且并且在線網(wǎng)站PredictProtein (http://www.predictprotein)的2D結(jié)構(gòu)進行預(yù)測：5)運用ClustalX2.0.12程序?qū)@些蛋白序列進行了多重比較。利用在線網(wǎng)站(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析MSX1蛋白序列和IRF6蛋白保守性；6)利用在線軟件Phyre (www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/)根據(jù)氨基酸序列一級保守性和已知蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測野生型和突變型IRF6蛋白的三維結(jié)構(gòu),并使用PyMOL軟件輸出圖像。研究結(jié)果在54例非綜合征性唇腭裂患兒中完成了MSX1和IRF6基因突變篩查。在編號13#患者中發(fā)現(xiàn)了MSX1基因第二外顯子上的一個錯義突變(c.492CG; p.Cys164Trp).先證者性別男,年齡1歲,單純型唇裂,父母表型正常,沒有唇腭裂家族史。在發(fā)現(xiàn)患兒存在MSX1基因突變后我們對父母追加了MSX1突變檢測,父母基因型與正常人一致。檢測到的突變位于cDNA序列的492位,編碼的氨基酸為半胱氨酸(Cys),患者該位點存在一個雜合的點突變,堿基由C變?yōu)镚,編碼的氨基酸變成色氨酸(Trp)。將人MSX1蛋白(NP 002439.2)和9種脊椎動物(P.troglodytes, M.mulatta、 C.lupus, B.taurus, M.musculus, R.norvegicus, G.gallus, D.rerio和X.tropicalis)的Msx1蛋白(NP_001182191.1, XP_001118871.2, XP_545946.2, NP_777223.1, NP_034965.2, NP_12321.1, NP_990819.1, NP_571348.1和NP_001032329.1)進行比對,結(jié)果顯示164位點的氨基酸Cys在生物進化過程中高度保守,提示該位點的突變可能導致氨基酸功能的改變。蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu)分析顯示,164Cys在為高度保守殘基,位于保守的2D片段。這個殘基的突變會影響人類MSX1蛋白質(zhì)的功能。其中,p.Cys164Trp這一突變由半胱氨酸替換為色氨酸,半胱氨酸為一含有側(cè)鏈的羥基氨基酸,這一突變可能會消除164Cys與鄰近殘基的靜電作用,由帶電殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橹行詺埢?帶電性質(zhì)的改變會嚴重影響蛋白的活性；另外半胱氨酸為親水基團而色氨酸是疏水基團,親疏水性質(zhì)的改變會影響蛋白的活性。Weblogo分析顯示在MSX1蛋白第164位堆棧只有C(Cys),表示該位點高度保守,提示我們該位點的突變可能導致蛋白質(zhì)功能的改變。在54例非綜合征性唇腭裂患兒中完成了IRF6基因測序,在一例散發(fā)性患兒中發(fā)現(xiàn)了IRF6基因的一個無義突變。研究編號40#,性別男,年齡1.5歲,單純型腭裂�；純菏巧l(fā)病例,沒有獲得親生父母的DNA,家族史不詳。測序結(jié)果與正常人基因組IRF6序列和對照組序列進行比對,顯示IRF6基因第9外顯子上的一個無義突變,可以導致IRF6蛋白在440位置終止(c.1320CG；p.Tyr440X).將人IRF6蛋白(NP_006138.1)和9種脊椎動物的(P.troglodytes, M.mulatta, C.lupus. B.taurus, M.musculus, R.norvegicus, G.gallus, D.rerio和X.tropicalis)的Irf6蛋白(XP_514168.2, XP_001110321.1, XP_005622392.1, NP_001070402.1, NP_058547.2, NP_001102329.1 XP_417990.4, NP_956892.1和NP_001025493.1)進行比對,結(jié)果顯示440位點的氨基酸之后的序列高度保守,提示該改變對蛋白質(zhì)功能影響較大。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,截短的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,提示突變以后對蛋白質(zhì)功能有一定影響。Weblogo分析顯示在IRF6蛋白第440位堆棧只有Y(Tyr),表示該位點高度保守,提示我們該位點的突變可能導致蛋白質(zhì)功能的改變。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示截短的突變型IRF6蛋白三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,并形成了α-螺旋減少,對蛋白質(zhì)功能造成了影響。研究結(jié)論本研究針對臨床收集到山東地區(qū)的先天性非綜合征性唇腭裂病例,主要從致病基因的突變檢測入手,進行分子病因?qū)W研究,以探索基因型和唇腭裂的相關(guān)性。本研究的第一部分通過對非綜合征性唇腭裂的MSXl基因的突變檢測和生物信息學分析,研究患者的致病基因和突變類型,以明確MSX1基因突變與臨床表型之間的相關(guān)性。本研究的第二部分通過對非綜合征性唇腭裂的IRF6基因的突變檢測和生物信息學分析,研究患者的致病基因和突變類型,以明確IRF6基因突變與臨床表型之間的相關(guān)性。以上研究得到如下結(jié)論：1、通過對臨床收集的非綜合征性唇腭裂患者MSX1基因篩查檢測,發(fā)現(xiàn)了一個可能導致非綜合征性唇腭裂的錯義突變。(1).在編號13#患者中發(fā)現(xiàn)了MSXl基因第二外顯子上的一個錯義突變(c.492G; p.Cysl64Trp)。檢測到的突變位于cDNA序列的492位,編碼的氨基酸為半胱氨酸(Cys),患者該位點存在一個雜合的點突變,堿基由C變?yōu)镚,編碼的氨基酸變成色氨酸(Trp)。先證者的父母不存在此突變類型,該突變?yōu)樾律蛔儭Ｄ壳皣鴥?nèi)并沒有關(guān)于MSX1突變可以導致非綜合征唇腭裂的發(fā)生報道,本研究是首次在中國人群非綜合征性唇腭裂患者中發(fā)現(xiàn)了一個MSXl基因突變。(2).對該位點進行生物信息學分析,顯示該位點在生物進化過程中高度保守,突變可能影響蛋白質(zhì)功能。將人MSX1蛋白和9種脊椎動物的Msx1蛋白進行比對,結(jié)果顯示164位點的氨基酸Cys在生物進化過程中高度保守,Weblogo分析顯示在MSX1蛋白第164位堆棧只有C(Cys),表示該位點高度保守。蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu)分析顯示,164Cys在為高度保守殘基,位于保守的2D片段。這個殘基的突變會影響人類MSX1蛋白質(zhì)的功能。以上研究都提示我們該位點的突變可能導致蛋白質(zhì)功能的改變。2、通過對臨床收集的非綜合征性唇腭裂患者IRF6基因篩查檢測,發(fā)現(xiàn)了一個可能導致非綜合征性唇腭裂的無義突變。(1).在54例非綜合征患兒中完成了IRF6基因測序,在一例散發(fā)性患兒中發(fā)現(xiàn)了IRF6基因的一個無義突變�；純菏巧l(fā)病例,沒有獲得親生父母的DNA,家族史不詳。測序結(jié)果與正常人基因組IRF6序列和對照組序列進行比對,顯示IRF6基因第9外顯子上的一個無義突變,可以導致IRF6蛋白在440位置終止(c.1320CG；p.Tyr440X)。目前國內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)于IRF6突變可以導致非綜合征唇腭裂的報道,本研究首次報道了IRF6上的一個新的突變,有助于擴大IRF6突變的表達譜,為深入理解IRF6基因與非綜合征性唇腭裂的關(guān)系打下了一定基礎(chǔ)。(2).生物信息學分析顯示,該突變對蛋白質(zhì)功能及結(jié)構(gòu)都有較大影響。將人IRF6蛋白和9種脊椎動物的的Irf6蛋白進行比對并進行Weblogo分析,結(jié)果顯示440位點的氨基酸之后的序列高度保守,蛋白質(zhì)二維和三維結(jié)構(gòu)分析也顯示突變蛋白截短后功能有一定改變。研究意義非綜合征性唇腭裂的致病基因一直是該領(lǐng)域研究的熱點和難點。本研究通過對臨床收集到非綜合征性唇腭裂病例進行致病基因的突變篩查,在中國人群中檢測到非綜合征性唇腭裂致病基因和新突變類型,并對突變蛋白進行了生物信息學分析,進一步驗證了突變蛋白和非綜合征性唇腭裂的聯(lián)系。本研究在首次發(fā)現(xiàn)了MSXl和IRF6基因上的兩個新的突變類型,并進行了生物信息學分析,不僅可以加深對此類疾病的認識,而且有利于更加全面深入地了解相關(guān)致病基因的結(jié)構(gòu)與功能,進而為研究非綜合征性唇腭裂的分子機制提供線索,提高臨床預(yù)防和治療此類疾病的水平。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R782.2

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