本文關(guān)鍵詞：SATB2-Nanog通路調(diào)節(jié)人牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞衰老及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：增齡性的骨量丟失與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的衰老密切相關(guān),來(lái)源于神經(jīng)嵴的牙槽骨擁有明顯的位點(diǎn)和衰老相關(guān)特性。然而牙槽骨來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells from alveolar bone, AB-BMSCs)的特性和其潛在調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不完全清楚。本課題在比較分析不同年齡牙槽骨來(lái)源BMSCs體外生物學(xué)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,探討核基質(zhì)蛋白特異AT序列結(jié)合蛋白2(special AT-rich binding protein 2, S ATB2)在調(diào)控AB-BMSCs增齡性特性變化中的作用及相關(guān)機(jī)制。第一部分：人牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征的增齡性變化目的：體外分離培養(yǎng)不同年齡組的AB-BMSCs,分析不同年齡組AB-BMSCs生物學(xué)特性及SATB2表達(dá)水平變化。方法：1)利用全骨髓貼壁法體外提取并培養(yǎng)人AB-BMSCs,待細(xì)胞從組織塊中爬出,換液去除未貼壁細(xì)胞及組織塊,當(dāng)形成單克隆集落并且當(dāng)各集落相互接觸時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；2)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、Western bolt和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)不同年齡組AB-BMSCs的SATB2表達(dá)差異；3)采用結(jié)晶紫染液染色培養(yǎng)8d不同年齡組AB-BMSCs,分析其克隆形成能力；4)通過(guò)CCK8法分析其增殖能力；5)通過(guò)Western bolt和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)不同年齡組AB-BMSCs的干性因子表達(dá)；6)通過(guò)礦化誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)BMSCs并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR、 Western bolt、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色和油紅O染色檢測(cè)BMSCs的多向分化能力；7)通過(guò)β-Gal染色、Western bolt分析不同年齡組AB-BMSCs衰老相關(guān)因子表達(dá)。結(jié)果：(1)隨著年齡增大AB-BMSCs中SATB2的表達(dá)量下降。(2)年輕組(young group, Y)的AB-BMSCs克隆集落明顯多于中年組(middle group, M)和老齡組(old group, O)細(xì)胞,隨著年齡的增加克隆形成能力下降；CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示從細(xì)胞培養(yǎng)第三天開(kāi)始同一時(shí)間點(diǎn)的年輕組AB-BMSCs吸光度值大于中年組大于老齡組細(xì)胞；隨著年齡的增大,AB-BMSCs中Nanog、性別決定區(qū)Y框蛋白2(SRY(sex determining region Y)-box 2, SOX2).八聚體轉(zhuǎn)錄因子4 (octamer-binding transcription factor-4,OCT4)蛋白表達(dá)水平下降。(3)AB-BMSCs中runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2, RUNX2)、OSX、骨橋素(osteopontin, OPN)等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平老齡組明顯低于年輕組和中年組,并且鈣結(jié)節(jié)形成能力下降；隨著年齡的增加老齡組AB-BMSCs中成脂相關(guān)因子Leptin、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體Y(peroxisomeproliferator-activated receptor gamma, PPAR-γ)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein alpha, C/EBP-α) mRNA高表達(dá),油紅O染色形成脂滴老齡組多于中年組多于年輕組；老齡組核因子-κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB, RANK)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulation factor, MCSF)等破骨因子mRNA高表達(dá),而骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)表達(dá)明顯下降,核因子-κ,B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL) mRNA表達(dá)中年組大于年輕組而老齡組表達(dá)水平最低。(4)隨著年齡增加衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞比例增加,抗氧化應(yīng)激性能力下降,P16、P21、P53等衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平增多。結(jié)論：隨著增齡性的變化,AB-BMSCs中SATB2表達(dá)水平下降；干性、成骨分化能力減弱；而成脂分化、細(xì)胞衰老及破骨激活能力增強(qiáng)。第二部分：SATB2表達(dá)水平對(duì)牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞干性及衰老的影響目的：分析過(guò)表達(dá)和敲減SATB2對(duì)AB-BMSCs的增殖能力、干性、衰老的影響和誘導(dǎo)成骨、成脂分化能力的調(diào)控。方法：1)SATB2過(guò)表達(dá)病毒載體轉(zhuǎn)染老年組AB-BMSCs, SATB2敲減病毒載體轉(zhuǎn)染年輕組AB-BMSCs,通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SATB2過(guò)表達(dá)BMSCs、轉(zhuǎn)染了GFP對(duì)照組及SATB2敲減的BMSCs和轉(zhuǎn)染了GFP對(duì)照組BMSCs的增殖能力；2)Western bolt實(shí)驗(yàn)分析Nanog、SOX2、OCT4等干細(xì)胞多潛能因子及衰老相關(guān)蛋白P16、P21、P53的表達(dá)；3)通過(guò)β-Gal染色分析不同處理組AB-BMSCs衰老表現(xiàn)；4)茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色和CPC實(shí)驗(yàn)分析不同處理組細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化能力；5)Western bolt測(cè)定RUNX2、OSX、OPN成骨相關(guān)因子蛋白表達(dá)；6)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Leptin、PPAR-γ、C/EBP-α成脂相關(guān)因子的mRNA表達(dá)。結(jié)果：(1)老年BMSCs過(guò)表達(dá)SATB2后,細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯改變,干性指標(biāo)表達(dá)升高,衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,P16、P21、P53衰老相關(guān)蛋白表達(dá)降低；誘導(dǎo)成骨能力增強(qiáng),RUNX2、OSX、OPN成骨相關(guān)因子蛋白表達(dá)增加；Leptin、PPAR-γ、 C/EBP-α成脂相關(guān)因子的mRNA表達(dá)下降。(2)與上述結(jié)果相反,年輕組BMSCs敲減SATB2后,細(xì)胞增殖能力下降,干性指標(biāo)表達(dá)下降,衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,P16、P21、P53衰老相關(guān)蛋白表達(dá)增加；誘導(dǎo)成骨能力下降,RUNX2、OSX、OPN成骨相關(guān)因子蛋白表達(dá)下降; Leptin、 PPAR-γ、C/EBP-α成脂相關(guān)因子的mRNA表達(dá)升高。結(jié)論：核基質(zhì)蛋白SATB2是AB-BMSCs增齡性特征變化的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。第三部分：SATB2-Nanog通路調(diào)控牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的機(jī)制研究目的：分析SATB2-Nanog通路調(diào)控AB-BMSCs多潛能因子表達(dá)、衰老相關(guān)特性和成骨能力的影響,探討該通路參與AB-BMSCs衰老的相關(guān)機(jī)制。方法；1)SATB2過(guò)表達(dá)病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染老年BMSCs后,小干擾RNA敲減Nanog,通過(guò)Western bolt實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Nanog、SOX2、OCT4等干細(xì)胞多潛能因子蛋白及mRNA表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)AB-BMSCs的Nanog表達(dá)差異；通過(guò)β-Gal染色分析衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；Western bolt實(shí)驗(yàn)測(cè)定P16、P21、P53衰老相關(guān)蛋白表達(dá)；茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色和Western bolt實(shí)驗(yàn)分析誘導(dǎo)成骨能力的變化。2)CHIP實(shí)驗(yàn)分析SATB2與Nanog DNA序列啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)；3).雙熒光素報(bào)告酶基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)驗(yàn)證SATB2與Nanog分子間可能存在的結(jié)合與調(diào)控關(guān)系。結(jié)果：(1)SATB2過(guò)表達(dá)病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染老年BMSCs小干擾RNA敲減Nanog后,Nanog、SOX2、OCT4等干細(xì)胞多潛能因子蛋白及mRNA表達(dá)下降；β-Gal染色分析衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多；P16、P21、P53衰老相關(guān)蛋白表達(dá)增多；誘導(dǎo)成骨能力下降。(2)CHIP結(jié)果顯示SATB2與Nanog啟動(dòng)子區(qū)四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合。(3)雙熒光素報(bào)告酶基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)四個(gè)陽(yáng)性結(jié)合位點(diǎn)中SATB2與Nanog啟動(dòng)子區(qū)第10號(hào)片段發(fā)生結(jié)合并參與調(diào)控基因表達(dá)。結(jié)論：SATB2調(diào)控AB-BMSCs增齡性特征是通過(guò)Nanog發(fā)揮作用,SATB2-Nanog軸調(diào)控AB-BMSCs的衰老及多潛能分化過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782

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4 楊發(fā)亮;房冬梅;鄒銀平;;淺析運(yùn)動(dòng)延緩衰老的機(jī)制[J];內(nèi)江科技;2011年10期

5 王福龍;王甄真;陳雁;;衰老的分子機(jī)制與干預(yù)研究的最新進(jìn)展[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2012年08期

6 孫明德;鄭集;;衰老的起因和機(jī)制[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1981年02期

7 吳鏡海;;人類生理衰老生物學(xué)[J];海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1985年03期

8 Roy A K;汪義和;;各種衰老理論的評(píng)價(jià)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊(cè));1986年04期

9 南新升,張宗玉,童坦君,張昌穎;衰老的遺傳控制[J];老年學(xué)雜志;1990年02期

10 陳禮湘;老年生理(1)[J];護(hù)士進(jìn)修雜志;1992年01期

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1 朱漢民;;衰老的生物指標(biāo)[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第三屆老年?duì)I養(yǎng)暨第二屆營(yíng)養(yǎng)與腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];1994年

2 傅文慶;;衰老及其治療[A];老齡問(wèn)題研究論文集（七）[C];2005年

3 童坦君;張宗玉;王文恭;;衰老相關(guān)基因研究進(jìn)展[A];老齡問(wèn)題研究論文集（十一）——積極老齡化研究之三[C];2006年

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