本文關(guān)鍵詞：涎腺腺樣囊性癌中低氧與自噬相關(guān)基因的生物信息學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： 生物信息學(xué) 涎腺腺樣囊性癌 自噬 低氧

【摘要】：研究背景：生物信息學(xué)是一門交叉學(xué)科,是結(jié)合數(shù)學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、工程學(xué)來處理生物學(xué)數(shù)據(jù)、研究生物學(xué)問題的新興學(xué)科,現(xiàn)已在分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。生物信息學(xué)在醫(yī)學(xué)生物學(xué)中最廣泛的應(yīng)用之一,就是在分析基因和蛋白表達(dá)、功能注釋以及調(diào)控機(jī)制的研究中,起到非常積極的作用；在遺傳學(xué)及基因組學(xué)領(lǐng)域,生物信息學(xué)技術(shù)可以幫助人們在測序和注釋基因組,以及和基因組相關(guān)的可變剪切、突變等方面獲得更多信息；生物信息學(xué)圖形技術(shù),例如圖像及信號處理技術(shù),允許科研人員從大量原始數(shù)據(jù)中提取有用的結(jié)果；在文本挖掘生物學(xué)文獻(xiàn)、生物學(xué)數(shù)據(jù)查詢中,生物信息學(xué)同樣扮演重要角色。目前生物信息學(xué)幾個重要的研究方面,包括表觀遺傳組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等,在腫瘤研究中都有廣泛的應(yīng)用。其中,代表基因表達(dá)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)是應(yīng)用的最為廣泛的一個方向。包含有數(shù)萬個基因表達(dá)情況的的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),反映了細(xì)胞或組織即刻的生理病理狀態(tài),同時反映了這一過程中基因的活動信息；通過對比不同條件或不同組織來源的基因表達(dá)情況,可以反應(yīng)內(nèi)在的基因?qū)用娴穆?lián)系,在尋找生物標(biāo)志物,探究疾病機(jī)制機(jī)理、評價藥物及其他治療手段效果等方面都有重要作用。目前,基因芯片是生物醫(yī)學(xué)研究中最常用的高通量基因檢測的手段之一�；蛐酒�,是微觀DNA點(diǎn)粘附在固體表面的集合,用芯片同時檢測大量基因表達(dá)水平或基因組多個區(qū)域的基因型。由于芯片包含數(shù)以萬計的探針,基因芯片實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲瓿稍S多并行基因測試,在生物醫(yī)學(xué)研究中,一方面可以通過運(yùn)用基因芯片,研究各類疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)部機(jī)制,建立調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；另一方面也可以應(yīng)用于尋找疾病的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),因此基因芯片技術(shù)極大地加速了很多疾病的研究。在現(xiàn)有的腫瘤研究,如肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸鱗癌等各類癌癥的研究中,基因芯片的應(yīng)用非常廣泛,然而,在涎腺腺樣囊性癌中,基因芯片的應(yīng)用相對較少。腺樣囊性癌是一種較為少見的惡性腫瘤,可發(fā)生在身體的許多部位,最常發(fā)生在頭頸部,尤其是涎腺,相對于粘液表皮樣癌、多形性腺瘤,腺樣囊性癌是最常見的涎腺惡性腫瘤之一。腺樣囊性癌易復(fù)發(fā),易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,同時早期即有侵犯神經(jīng)等較為獨(dú)特的生物學(xué)行為,目前主要的治療手段是手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療,接受手術(shù)的原發(fā)腺樣囊性癌病例的五年、十年、十五年、二十年、二十五年的生存率分別為77.3%,59.6%,44.9%,35.0%,25.5%,總體療效仍然不能令人滿意。近年來,隨著生物醫(yī)學(xué)研究的逐步深入,人們對于腺樣囊性癌的發(fā)生發(fā)展的研究取得了很大的進(jìn)展。許多原癌基因、抑癌基因被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,與此同時,也有很多生物學(xué)信號通路被發(fā)現(xiàn)在涎腺腺樣囊性癌中過度的活躍或抑制,如mTOR信號通路、NOTCH1信號通路、p53信號通路等等。自噬是在組織微環(huán)境較為惡劣的情況下,細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分通過溶酶體被降解,在自噬溶酶體中,待降解物質(zhì)在各種酶和蛋白的作用下,分解成氨基酸和核苷酸等,通過三羧酸循環(huán),產(chǎn)生可以被重新利用的小分子,是細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)機(jī)制。在生物進(jìn)化過程中,自噬這一生物學(xué)過程非常保守,廣泛的存在于真核細(xì)胞的胚胎發(fā)育、炎癥、氧化應(yīng)激、低氧、缺血等各種生理或病理過程中。自噬與腫瘤的關(guān)系同樣是自噬研究中的一個熱點(diǎn)問題,現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn),自噬可能參與到了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等眾多環(huán)節(jié)。而在自噬的啟動方面,低氧是報道最多的環(huán)境因素。低氧作為腫瘤發(fā)展過程中不可避免的微環(huán)境之一,對腫瘤的進(jìn)展起到了非常重要的作用。在低氧條件下,腫瘤細(xì)胞通過改變某些調(diào)控因子和蛋白,激活特定的信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動,這其中就包括自噬。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn),在腫瘤中低氧可以誘導(dǎo)自噬,上調(diào)自噬水平,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存,同時促進(jìn)腫瘤的生長,在結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌中,都有大量關(guān)于低氧誘導(dǎo)自噬的相關(guān)報道。在這一過程中,低氧誘導(dǎo)因子1 α作為細(xì)胞應(yīng)對低氧微環(huán)境的重要轉(zhuǎn)錄因子,通過對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá),在調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)的自噬中起重要作用。因此在低氧誘導(dǎo)自噬這一生物信號通路中,低氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)與自噬基因的關(guān)系,很大程度上反應(yīng)了低氧與自噬的內(nèi)在聯(lián)系,是研究低氧自噬的關(guān)鍵。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)低氧自噬相關(guān)基因在涎腺腺樣囊性癌中表達(dá)活躍,與腫瘤的生存及轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。然而,涎腺腺樣囊性癌中,用生物信息學(xué)技術(shù)在基因整體表達(dá)水平上對低氧自噬的分析尚未有相關(guān)報道。研究目的：在我們課題組的前期研究中,自噬信號通路與涎腺腺樣囊性癌的預(yù)后有顯著的相關(guān)性,因此在本研究中,我們在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)手段,重點(diǎn)研究自噬這一信號通路在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)情況,并分析自噬信號通路在基因水平上的富集情況,探索在涎腺腺樣囊性癌低氧自噬中,低氧誘導(dǎo)因子1α與自噬相關(guān)基因的關(guān)系,以期對其在涎腺腺樣囊性癌中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制有更深入的研究。研究方法：1.從GEO數(shù)據(jù)庫篩選、下載并預(yù)處理相關(guān)數(shù)據(jù)集,獲得涎腺腺樣囊性癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。2.應(yīng)用R語言,Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。3.進(jìn)行文獻(xiàn)檢索,收集整理自噬相關(guān)基因。4.應(yīng)用超幾何分布檢驗(yàn)進(jìn)行自噬通路的富集分析。5.對低氧誘導(dǎo)因子1α基因與自噬基因進(jìn)行相關(guān)分析,并選擇有正相關(guān)性的一個自噬基因作為靶基因,作為下一步的研究對象。6.應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢驗(yàn)涎腺腺樣囊性癌組織中低氧誘導(dǎo)因子1α基因與靶基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)情況。7.應(yīng)用二氯化鈷在細(xì)胞系A(chǔ)CC-M中構(gòu)建低氧模型,通過免疫熒光技術(shù),檢測是否有自噬的產(chǎn)生。8.應(yīng)用二氯化鈷在細(xì)胞系A(chǔ)CC-M中構(gòu)建低氧模型,作用0小時、6小時、12小時、24小時后,應(yīng)用R T-PCR技術(shù),Western blot技術(shù)檢測低氧誘導(dǎo)因子1α基因與靶基因的表達(dá)是否具有一致性。研究結(jié)果：1.在數(shù)據(jù)集GSE59701中,共有20201個基因的表達(dá)值,以表達(dá)值差異超過2倍或者小于0.5倍,P值小于0.05為篩選條件,共篩選出764個上調(diào)基因,占總基因數(shù)的3.78%；545個下調(diào)基因,占總基因數(shù)的2.70%。2.根據(jù)文獻(xiàn)收集整理出26個自噬相關(guān)基因。3.在上調(diào)表達(dá)基因中,以P值小于0.05為篩選條件,對以上26個自噬相關(guān)基因簇進(jìn)行富集分析,P值等于0.008223,判定該通路上調(diào)；在下調(diào)表達(dá)基因中,對以上26個自噬相關(guān)基因簇進(jìn)行富集分析,P值等于0.446729,無法判定該通路為下調(diào)。4.采用了Spearman相關(guān)系數(shù),P值小于0.05為篩選條件,有五個基因ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4和MAP1LC3B與低氧誘導(dǎo)因子1α基因的表達(dá)顯著正相關(guān)。5.選擇MAP1LC3B為靶基因。71例涎腺腺樣囊性癌患者的腫瘤組織切片中,進(jìn)行免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),53例可以觀察到低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)陽性,40例可以觀察至MAP1LC3B對應(yīng)蛋白表達(dá)陽性,25例患者中,低氧誘導(dǎo)因子1α與MAP1LC3B對應(yīng)蛋白同時表達(dá)陽性。6.選取200μmol/ L的二氯化鈷為作用濃度,對ACC-M細(xì)胞作用24小時后,通過免疫熒光技術(shù)檢測證實(shí),可以誘導(dǎo)ACC-M細(xì)胞株中自噬體的產(chǎn)生。7.選取200u mol/L的二氯化鈷為作用濃度,對ACC-M細(xì)胞作用0小時、6小時、12小時、24小時后,通過RT-PCR檢測與Western blot檢測證實(shí),低氧誘導(dǎo)因子1 a與基因MAP1LC3B在基因水平和蛋白水平中表達(dá)一致性上調(diào)。研究結(jié)論：本研究顯示,涎腺腺樣囊性癌中自噬信號通路在基因水平上明顯上調(diào),低氧誘導(dǎo)因子1α基因與ATG3、ATG4A、ATG5、PIK3R4 和 MAP1LC3B五個基因自噬基因的表達(dá)有正相關(guān)性,表達(dá)趨勢一致。經(jīng)臨床及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,在低氧狀態(tài)下,基因MAP1LC3B與低氧誘導(dǎo)因子1α基因的基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的確存在著一致性上調(diào)現(xiàn)象,為涎腺腺樣囊性癌下一步的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供了新的思路,但其具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探索。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊晨;李萍;梁廷明;;細(xì)胞自噬與腫瘤的關(guān)系研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2015年02期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王丹丹;介孔二氧化硅納米微粒共轉(zhuǎn)運(yùn)Doxorubicin和MDR1-siRNA治療耐藥口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究[D];吉林大學(xué);2015年

，

本文編號：1252440