本文關(guān)鍵詞：BET抑制劑JQ1在壓應(yīng)力介導(dǎo)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎樣病理變化中的作用機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分BET抑制劑JQ1對(duì)超負(fù)荷應(yīng)力作用下大鼠髁突軟骨炎癥的作用研究[目的]檢測(cè)BET抑制劑JQ1能否抑制壓力源性的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨炎癥,探究JQ1的內(nèi)在作用機(jī)制。[方法]選擇96只7周齡雄性SD大鼠用于實(shí)驗(yàn),按本課題組自主設(shè)計(jì)的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)壓應(yīng)力加載動(dòng)物模型裝置(專(zhuān)利號(hào)：201120210396.4),對(duì)加力組大鼠髁突軟骨施加向上、向后的壓應(yīng)力(80g),加力時(shí)間設(shè)4天、7天和14天3個(gè)時(shí)間梯度,非加力組大鼠進(jìn)行同樣的操作但不實(shí)施實(shí)質(zhì)性的壓應(yīng)力加載；由于14天組軟骨下骨變化最為顯著,因此我們選擇14天為實(shí)驗(yàn)周期。再使用BET抑制劑JQ1進(jìn)行處理,設(shè)置5μM、10μM、50μM三個(gè)濃度梯度。采用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察加力及加藥后大鼠髁突軟骨厚度、炎性浸潤(rùn)情況以及形態(tài)學(xué)變化。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)改變；因?yàn)?0μM組JQ1作用效果最為顯著,后續(xù)實(shí)驗(yàn)JQ1濃度均為50μM；免疫組化檢測(cè)炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)改變；染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)Brd4與TNF-α、IL-8啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況變化。[結(jié)果]1.HE染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,單純藥物處理髁突軟骨厚度未見(jiàn)明顯變化。加力4天后大鼠髁突軟骨變薄(34%,P0.01),加力7天和14天大鼠髁突軟骨顯著變薄(7天,58%,P0.01；14天,60%,P0.01),兩組間無(wú)明顯差異,但是骨破壞程度14天組較7天組更為嚴(yán)重。JQ1(5μM、10gM、50gM)處理后能緩解14天壓應(yīng)力導(dǎo)致的大鼠髁突軟骨的變薄,其中50μM組效果最為顯著(5μM組恢復(fù)29%,P0.05；10μM組恢復(fù)36%,P0.01；50μM組恢復(fù)93%,P0.01)。2.qRT-PCR結(jié)果顯示14天壓應(yīng)力加載后大鼠髁突軟骨細(xì)胞炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)顯著升高,JQl可以抑制壓力源性的上述因子表達(dá)升高,50μM組效果最為顯著。IHC結(jié)果顯示50μM JQ1可以抑制壓力源性TNF-α和IL-1β升高。單純加藥組與空白對(duì)照在上述各項(xiàng)中亦無(wú)顯著差異。3.chIP結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,加力組Brd4與TNF-α、IL-8啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合增多,加力加藥組兩者結(jié)合較加力組降低。對(duì)照組、單純加藥組無(wú)顯著差異。[結(jié)論]BET抑制劑JQ1可以緩解超負(fù)荷應(yīng)力刺激下的大鼠髁突軟骨的變薄。BET抑制劑JQ1可以通過(guò)抑制超負(fù)荷應(yīng)力作用下髁突軟骨Brd4與炎性因子啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合,從而降低超負(fù)荷應(yīng)力介導(dǎo)的髁突軟骨炎性因子表達(dá),這一效應(yīng)具有濃度依賴(lài)性。第二部分BET抑制劑JQ1對(duì)超負(fù)荷應(yīng)力作用下大鼠髁突軟骨下骨骨破壞的作用研究[目的]探究BET抑制劑JQ1能否通過(guò)抑制破骨細(xì)胞分化成熟,緩解超負(fù)荷應(yīng)力導(dǎo)致的大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨下骨骨破壞。[方法]建模方法及分組同前,實(shí)驗(yàn)周期為14天,使用50μM濃度JQ1。采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察加力及加藥后大鼠髁突軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)量變化；采用Micro-CT進(jìn)行三維重建,檢測(cè)大鼠髁突軟骨下骨骨小梁形態(tài)變化,包括：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隔(Tb.Sp)的變化；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)破骨細(xì)胞分化標(biāo)志因子RANKL、 RANK、NFATcl、TRAP、Cathepsin K的表達(dá)改變。[結(jié)果]1. TRAP染色顯示：對(duì)照組和單純加藥組未見(jiàn)明顯差異。加力組TRAP染色陽(yáng)性,破骨細(xì)胞數(shù)量增多。加力加藥組破骨細(xì)胞數(shù)量較單純加力組顯著減少(25%,P0.05)。2. Micro-CT顯示對(duì)照組和單純加藥組大鼠髁突軟骨下骨形態(tài)無(wú)明顯差異。加力后,大鼠髁突軟骨下骨的BV/TV、Tb.N以及Tb.Th減少,同時(shí)Tb.Sp增加。加力加藥后,大鼠髁突軟骨下骨的BV/TV、Tb.Th(BV/TV增加27%,P0.01；Tb.Th增加9%,P0.01)均有所恢復(fù)。3. qRT-PCR結(jié)果顯示：壓應(yīng)力加載后大鼠髁突破骨細(xì)胞分化標(biāo)志因子RANKL、RANK、NFATc、TRAP、Cathepsin K的表達(dá)顯著升高。而當(dāng)關(guān)節(jié)腔注射JQ1后,可以抑制上述情況的發(fā)生。單純加藥組與空白對(duì)照在上述各項(xiàng)中亦無(wú)顯著差異。[結(jié)論]BET抑制劑JQl可以減少超負(fù)荷應(yīng)力作用下的大鼠髁突軟骨下骨破骨細(xì)胞數(shù)目、抑制髁突軟骨下骨骨吸收。其內(nèi)在機(jī)制與BET抑制劑JQ1抑制了超負(fù)荷應(yīng)力介導(dǎo)的髁突軟骨下骨中破骨細(xì)胞分化成熟有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R782.6

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