本文關(guān)鍵詞：牙周膜來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立和應(yīng)用

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【摘要】：國內(nèi)外學(xué)者一直致力于通過組織工程的方法來進(jìn)行再生醫(yī)學(xué)的研究,而種子細(xì)胞是組織工程的必要條件之一。鑒于其具有多向分化能力,干細(xì)胞被認(rèn)為是良好的種子細(xì)胞來源。在牙周再生領(lǐng)域,再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展也為組織修復(fù)再生提供了新的策略,而牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是牙周組織中天然存在的干細(xì)胞,也是目前牙周組織工程最有潛力的種子細(xì)胞之一,具有成骨、成牙骨質(zhì)等多種分化潛能,但天然的PDLSCs存在較少,且分離培養(yǎng)和篩選過程復(fù)雜,很難大量的培養(yǎng)以作為組織再生的種子細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是從早期胚胎中分離得到的干細(xì)胞,在不同的培養(yǎng)條件下,具有分化為多種類型的細(xì)胞的潛力,但是由于受到倫理問題的限制,目前僅能用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),因此科學(xué)家們開始嘗試其他方式來獲得分化能力更強(qiáng)的細(xì)胞。細(xì)胞重編程是將已分化成熟的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為未分化狀態(tài)的過程,而被重編程后的細(xì)胞具有多能性,具備分化為機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞類型的潛能。誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是近幾年來干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。2006年,京都大學(xué)的Yamanaka研究團(tuán)隊(duì)革命性得將小鼠成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)為iPSCs。誘導(dǎo)成功的iPSCs不僅在細(xì)胞形態(tài)和分化潛能方面都類似于ESCs,而且避免了圍繞ESCs使用的倫理學(xué)問題�；蛑鼐幊陶T導(dǎo)多能干細(xì)胞使得為了臨床治療目的,采用轉(zhuǎn)錄因子將細(xì)胞從一種細(xì)胞系逆轉(zhuǎn)到另一種細(xì)胞系成為可能。這一前沿研究成果也為解決骨再生問題,乃至于重建牙周組織提供了全新的思路：如果可以通過誘導(dǎo)重編程技術(shù)直接將體外培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞去分化為多能干細(xì)胞,作為“種子細(xì)胞”用于牙周組織工程,將有助于突破困擾該領(lǐng)域進(jìn)展的瓶頸。在臨床中,通過阻生牙和正畸牙的拔除,我們可以獲得牙周膜,從而利用其培養(yǎng)出牙周膜細(xì)胞,進(jìn)而將其誘導(dǎo)成為iPSCs,作為牙周組織工程的種子細(xì)胞來使用。另外,細(xì)胞膜片技術(shù)是在組織再生中具有廣闊應(yīng)用前景的一項(xiàng)技術(shù)。它不僅可以很好地保存細(xì)胞外基質(zhì),還能減少細(xì)胞移植后無效移植細(xì)胞的數(shù)量和支架材料的使用,有利于組織的再生。將重編程得到的多能干細(xì)胞在體外制備成細(xì)胞膜片用于牙周組織工程中,也可以成為牙周組織再生的新方式。[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯本研究的目的即原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞,將外源性基因(Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc)通過病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來對(duì)人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行重編程,然后對(duì)構(gòu)建成功的hPDLC-iPSCs進(jìn)行生物學(xué)鑒定。鑒定證實(shí)細(xì)胞構(gòu)建成功后進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)hPDLC-iPSCs的成骨分化能力,最后利用hPDLC-iPSCs形成的細(xì)胞膜片植入裸鼠頭蓋骨缺損,評(píng)價(jià)其體修復(fù)骨缺損的能力,為今后在牙周組織工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。[材料與方法]本課題的研究?jī)?nèi)容分為以下四個(gè)部分：第一部分人牙周膜來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立1.1人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)的原代培養(yǎng)及鑒定取健康患者正畸牙,組織塊法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞,運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物(波形蛋白、角蛋白、纖連蛋白和Ⅰ型膠原酶)進(jìn)行鑒定。1.2 CF-1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備從孕13.5天CF-1胚胎組織中分離提取纖維細(xì)胞并擴(kuò)增輻照處理細(xì)胞1小時(shí),凍存?zhèn)溆谩?.3慢病毒的包裝及感染hPDLCs將攜帶Oct-4、Sox-2、c-Myc和klf-4基因的載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48小時(shí)后收集上清液并進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。用包裝攜帶外源性目的基因的病毒液感染牙周膜細(xì)胞。1.4病毒感染后的細(xì)胞培養(yǎng)以及挑取iPSCs克隆將感染后的細(xì)胞鋪于MEF細(xì)胞上,更換為hESCs培養(yǎng)基,3-4周后挑取克隆,選擇堿性磷酸酶陽性細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二部分人牙周膜來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的鑒定確認(rèn)通過誘導(dǎo)確實(shí)獲得了牙周膜來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hPDLC-iPSCs):2.1細(xì)胞的形態(tài)觀察觀察誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞,與誘導(dǎo)前的PDLCs以及hESCs的形態(tài)進(jìn)行對(duì)比。2.2 iPSCs堿性磷酸酶(Alkaline phosphatasee,AP)染色檢測(cè)誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞的堿性磷酸酶活性,并與hESCs進(jìn)行對(duì)比。2.3 iPSCs免疫熒光染色免疫熒光染色檢測(cè)誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞是否表達(dá)hESCs特異性蛋白,包括胞膜蛋白(SSEA3、SSEA4),胞質(zhì)蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和胞核蛋白(Oct-4、 Nanog)。2.4體內(nèi)分化畸胎瘤實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,注射到裸鼠背部和大腿內(nèi)側(cè),觀察是否有畸胎瘤形成。并對(duì)形成的畸胎瘤進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,鏡下觀察形成組織的情況,判斷細(xì)胞是否具有向三個(gè)胚層組織分化的潛能。2.5擬胚體實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng),觀察是否形成腔體形態(tài),腔體形成七天后,進(jìn)行貼壁培養(yǎng),觀察是否有細(xì)胞爬出。第三部分人牙周膜來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外成骨能力的評(píng)價(jià)3.1 hPDLC-iPSCs、hESCs以及PDLCs的成骨誘導(dǎo)分別培養(yǎng)hPDLC-iPSCs、hESCs以及PDLCs三種細(xì)胞,形成擬胚體后貼壁培養(yǎng),常規(guī)培養(yǎng)后更換礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松)。3.2礦化結(jié)節(jié)形成茜素紅染色觀察細(xì)胞誘導(dǎo)礦化14天后的礦化結(jié)節(jié)形成情況,并定量分析。3.3ALP水平檢測(cè)運(yùn)用PNPP法定量檢測(cè)細(xì)胞在誘導(dǎo)礦化7和14天的ALP活性。3.4 real-time PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天和14天后的成骨相關(guān)基因(ALP、OCN、Col-I和Runx2)表達(dá)。第四部分人牙周膜來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞膜片在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用4.1 hPDLC-iPSCs、hESCs以及hPDLCs細(xì)胞膜片的制備三種細(xì)胞均在加入維生素C的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天,培養(yǎng)后期可見培養(yǎng)皿底部形成透明白色膜,即成功得到細(xì)胞膜片,小心刮下后得到細(xì)胞膜片,待用。4.2裸鼠頭蓋骨缺損模型的建立以及細(xì)胞膜片的修復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)立三個(gè)小組,hPDLC-iPSCs膜片組、hESCs膜片組以及hPDLC膜片組；水合氯醛麻醉裸鼠,切開頭部皮膚,暴露頭蓋骨,利用3.5mm環(huán)鉆創(chuàng)造骨缺損,小心去除骨片后,在創(chuàng)口植入刮除的細(xì)胞膜片,拉攏頭部皮膚,縫合,注射抗生素。4.3細(xì)胞膜片評(píng)價(jià)分別在手術(shù)4周和8周后,處死裸鼠后取材,多聚甲醛固定后,進(jìn)行micro-CT重建分析,之后HE染色和Masson染色觀察分析。[結(jié)果]1.原代培養(yǎng)一周后,可見細(xì)胞從組織塊中爬出。免疫熒光顯示細(xì)胞的波形蛋白、纖連蛋白和Ⅰ型膠原酶的表達(dá)為陽性,角蛋白為陰性,證明該培養(yǎng)的細(xì)胞為PDLCs。2.第一周后可見PDLCs形態(tài)發(fā)生變化,由梭形成纖維細(xì)胞狀變?yōu)榫奂膱A形克隆狀,在3周后左右挑取克隆后發(fā)現(xiàn)有AP染色呈陽性,且具有典型的hESCS克隆形態(tài)。重編程成功的細(xì)胞表達(dá)ESCS特異性蛋白,包括胞膜蛋白(SSEA3、 SSEA4),胞質(zhì)蛋白(TRA-1-60、TRA-1-81)和胞核蛋白(Oct-4、Nanog),能形成畸胎瘤,具有向三個(gè)胚層分化的潛力,且能在體外形成擬胚體。3.成骨誘導(dǎo)14天后,茜素紅染色顯示hPDLC-iPS組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)多于其他兩組,而ALP的檢測(cè)結(jié)果也與染色保持一致。另外,成骨相關(guān)因子ALP、OCN、Col-I和Runx2在hPDLC-iPSCs中的表達(dá)也更高,表明hPDLC-iPSCs的成骨能力強(qiáng)于hES和PDLCs。4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)了三個(gè)小組,hPDLC-iPSCs、hESCS和PDLC膜片均培養(yǎng)成功,micro-CT重建分析發(fā)現(xiàn)hPDLC-iPSCs膜片對(duì)骨缺損的修復(fù)作用明顯強(qiáng)于另外兩種細(xì)胞膜片,而HE染色和Masson染色也說明hPDLC-iPSCs膜片的新骨形成更多。[結(jié)論]1.通過慢病毒轉(zhuǎn)染hPDLCs,誘導(dǎo)獲得的細(xì)胞堿性磷酸酶陽性,能夠表達(dá)hESCs特異性的表面標(biāo)記,并且具有形成畸胎瘤向三胚層分化等能力,說明hPDLC-iPSCs構(gòu)建成功。2.本研究結(jié)果提示,誘導(dǎo)得到的hPDLC-iPSCs在體外具有良好的成骨作用,與hESCs相比,hPDLC-iPSCs能更快地誘導(dǎo)成骨礦,且相關(guān)成骨因子表達(dá)明顯比hESCs以及未誘導(dǎo)的PDLCs更強(qiáng)。3.基于組織工程方法誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)后形成的細(xì)胞膜片,是一種較簡(jiǎn)單、有效的骨缺損修復(fù)手段,在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,相比hESCs和hPDLCs膜片,hPDLC-iPSCs膜片能更好的修復(fù)頭蓋骨缺損,在骨組織工程中具有良好的應(yīng)用前景。4.綜合以上結(jié)論,hPDLC-iPSCs為牙周再生的組織工程修復(fù)提供了新的選擇,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781

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本文編號(hào)：1224271