本文關(guān)鍵詞：微溝槽鈦表面抗菌肽生物涂層的抗菌性能及其對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

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【摘要】：種植體頸部與植體周圍軟組織形成的軟組織封閉對(duì)種植體長期成功率極為重要,它也是預(yù)防種植體周圍炎重要因素之一。根據(jù)“the race for the surface”理論,在種植體生物材料的表面,細(xì)菌的粘附和組織的結(jié)合存在一個(gè)競爭的關(guān)系。如果組織細(xì)胞在競爭中占優(yōu)那么就能形成良好的組織整合,反之亦然。因此為了形成一個(gè)良好的、有功能的軟組織封閉,種植體頸部需具備以下兩個(gè)性能:1、種植體頸部需對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)具有較好的粘附和增殖誘導(dǎo)作用;2、種植體頸部需具備良好的抗菌性能。目前研究發(fā)現(xiàn),微溝槽結(jié)構(gòu)的鈦表面能夠?qū)е滤^的“接觸誘導(dǎo)”,有利于HGFs的粘附、增殖,同時(shí)促進(jìn)各種基因和蛋白的表達(dá)。大部分研究認(rèn)為60μm寬、10μm深的微溝槽最適合種植體頸部設(shè)計(jì)。近年來抗菌肽的出現(xiàn)為種植體表面抗菌涂層的研究帶來了新的思路,抗菌肽具有抗菌譜廣、無組織細(xì)胞毒性、細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。通過將抗菌肽修飾到溝槽結(jié)構(gòu)的鈦表面,可以將兩者結(jié)合起來并各自發(fā)揮其作用,形成良好的軟組織封閉。目的:本課題通過3-氯丙基三乙氧基硅烷(CPTES)硅烷化這一生物活化方法將抗菌肽修飾到具有60μm寬、10μm深的微溝槽結(jié)構(gòu)的鈦表面,通過檢測其理化性能確定其是否修飾成功,同時(shí)檢測其機(jī)械穩(wěn)定性;通過體外細(xì)菌培養(yǎng)觀察其對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果;通過體外細(xì)胞培養(yǎng)評(píng)價(jià)其對(duì)HGFs的粘附、增殖的影響,并觀察微溝槽結(jié)構(gòu)所具有的“接觸誘導(dǎo)”效應(yīng)。方法:利用硅烷化的方法將抗菌肽GL13K共價(jià)修飾到微溝槽鈦表面,通過X線能譜儀、場發(fā)射掃描電鏡、原子力顯微鏡、接觸角檢測儀等對(duì)材料表面的元素成分、形貌、粗糙度及潤濕性等理化性能進(jìn)行檢測,判斷其修飾成功與否。修飾成功后通過比較物理吸附和硅烷化修飾抗菌肽在超聲2h前后的抗菌肽熒光變化、表面元素的變化、接觸角變化情況來檢查其機(jī)械穩(wěn)定性。將牙齦卟啉單胞菌接種到不同材料表面,通過吖啶橙染色檢測粘附能力、平板計(jì)數(shù)檢測殺菌能力、細(xì)菌活性檢測等評(píng)價(jià)抗菌肽涂層的抗菌性能。將HGFs接種到不同材料表面,通過DAPI染色檢測細(xì)胞的粘附能力、CCK8檢測細(xì)胞增殖能力、免疫熒光和掃描電鏡檢測細(xì)胞形態(tài)和接觸誘導(dǎo)效應(yīng)。結(jié)果:(1)理化性能檢測:微溝槽表面硅烷化修飾抗菌肽后,XPS顯示其表面出現(xiàn)了抗菌肽所特有的N元素,且C元素的含量明顯增加,證明了抗菌肽成功修飾。修飾后鈦表面的粗糙度由原來的1.71±0.05nm增加到28.86±4.48nm;接觸角由60.68±2.89?增加到101.6±6.75?,因此,修飾了抗菌肽GL13K的微溝槽鈦表面表現(xiàn)為疏水性且更為粗糙。涂層機(jī)械穩(wěn)定性檢測:硅烷化后修飾抗菌肽的材料超聲2h前后,其表面標(biāo)記FITC熒光的抗菌肽幾乎沒有變化;而直接物理吸附抗菌肽的材料超聲2h前后,其表面標(biāo)記FITC熒光的抗菌肽明顯減少,XPS與接觸角檢測的結(jié)果與熒光結(jié)果相似,都證明了硅烷化修飾的抗菌肽涂層具有機(jī)械穩(wěn)定性。(2)抗細(xì)菌粘附:在不同的材料表面接種相同濃度的牙齦卟啉單胞菌,分別培養(yǎng)12h、24h、72h后吖啶橙染色結(jié)果顯示光滑、微溝槽、抗菌肽涂層的光滑或微溝槽材料表面其細(xì)菌的數(shù)量大致一樣,說明在微溝槽鈦表面增加的抗菌肽涂層并沒有抗細(xì)菌粘附的性能。殺菌試驗(yàn):將粘附在材料表面的細(xì)菌離心后稀釋,接種到BHI瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng),三個(gè)時(shí)間段都顯示具有抗菌肽涂層的微溝槽材料表面的CFUs明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。細(xì)菌代謝活性:細(xì)菌在材料表面培養(yǎng)三個(gè)時(shí)間段后,進(jìn)行WST-8生物活性測試,發(fā)現(xiàn)具有抗菌肽涂層的微溝槽材料表面的OD值明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),與CFUs的結(jié)果幾乎一致。證明了抗菌肽GL13K修飾到微溝槽材料表面后仍有很好的殺菌作用。(3)細(xì)胞粘附:用DAPI染料對(duì)接種在光滑、微溝槽、抗菌肽涂層的微溝槽材料表面2h、4h、6h后的HGFs細(xì)胞核進(jìn)行染色,并在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)2h時(shí)三種材料表面的細(xì)胞數(shù)量無差異;4h、6h時(shí)微溝槽組與抗菌肽涂層的微溝槽組材料表面的細(xì)胞數(shù)量均多于光滑組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);6h時(shí)抗菌肽涂層的微溝槽組材料表面的細(xì)胞數(shù)量又多于溝槽組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞增殖:所有時(shí)段抗菌肽涂層的微溝槽組表面細(xì)胞數(shù)量多于微溝槽組,且微溝槽組又多于光滑組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。細(xì)胞形態(tài)和排列方向:微溝槽組和抗菌肽涂層的微溝槽組的HGFs呈細(xì)長型并沿著溝槽的方向平行排列,而光滑組的細(xì)胞呈橢圓形、不規(guī)則排列。結(jié)論:采用CPTEs硅烷化的方法將抗菌肽GL13K穩(wěn)定地修飾在具有微溝槽的鈦表面,其機(jī)械性能穩(wěn)定性使其不被種植體植入時(shí)的旋轉(zhuǎn)力及齦溝液流的壓力所破壞。微溝槽鈦表面修飾抗菌肽后,形成了一個(gè)微米級(jí)與納米級(jí)混合的表面,不但具有良好的殺菌效果,還能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長。同時(shí)微溝槽結(jié)構(gòu)所特有的“接觸誘導(dǎo)”效應(yīng)仍然保存。這一材料一方面具有殺菌性能,另一方面具有促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖的生物活性,從兩方面作用使之形成良好的種植體軟組織封閉。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R783.6

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1179777