發(fā)布時(shí)間：2017-11-12 08:09

  本文關(guān)鍵詞：Nell-1對(duì)人牙髓細(xì)胞炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的體外研究

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【摘要】：目的：Nell-1蛋白(Nel-like molecule-1)是一種于顱縫早閉患者的早閉區(qū)發(fā)現(xiàn)的新型分泌蛋白。Nell-1對(duì)成骨細(xì)胞分化、礦化及骨的形成、再生有明顯的誘導(dǎo)作用。最新研究發(fā)現(xiàn)Nell-1蛋白可抑制BMP-2誘導(dǎo)的骨組織炎癥反應(yīng),減輕BMP-2在誘導(dǎo)骨形成時(shí)的副作用。牙體組織和骨組織在組織來(lái)源上具有同源性(均來(lái)源于神經(jīng)嵴),基因結(jié)構(gòu)上具有許多相似性,由此推測(cè)Nell-1蛋白可能參與調(diào)控牙髓炎中炎性因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探索人重組Nell-1蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)Nell-1蛋白)對(duì)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞相關(guān)炎性因子(IL-6、IL-8)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及其可能的機(jī)制。材料和方法：1、利用酶消化組織塊法培養(yǎng)人牙髓原代細(xì)胞,用第4-6代牙髓細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、將人牙髓細(xì)胞與濃度分別為0、100、200、4OOng/ml的Nell-1蛋白及l(fā)Ong/mlLPS共培養(yǎng)24小時(shí)。并設(shè)立空白對(duì)照組。利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)IL-6、IL-8相關(guān)基因的表達(dá),初步探索Nell-1對(duì)人牙髓細(xì)胞炎性因子表達(dá)的作用并確定Nell-1的最低有效作用濃度。3、利用Nell-1的最低有效作用濃度(200ng/m 1)和lOng/ml LPS共同作用人牙髓細(xì)胞,分別培養(yǎng)3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、1天、3天、7天,利用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-8在不同時(shí)間點(diǎn)上mRNA及蛋白表達(dá)情況。4、將人牙髓細(xì)胞與200ng/ml Nell-1蛋白、lOng/ml LPS、10μmol/L MAPK蛋白激酶抑制劑共培養(yǎng)24小時(shí),通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：1、利用組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出了牙髓原代細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng)后獲得了狀態(tài)良好的牙髓細(xì)胞。2、用不同濃度梯度的Nell-1蛋白和10ng/mlLPS處理牙髓細(xì)胞24小時(shí),發(fā)現(xiàn)10ng/mlLPS對(duì)牙髓細(xì)胞中IL-6、IL-8的表達(dá)具有明顯誘導(dǎo)作用(p0.01)。與對(duì)照組相比,200ng/mlNell-1蛋白可顯著抑制牙髓細(xì)胞中IL-6(p0.05)、IL-8(p0.01)的表達(dá)。3、用200ng/mlNell-1蛋白和10ng/mlLPS處理牙髓細(xì)胞3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、3天、7天,發(fā)現(xiàn)LPS的致炎作用具有時(shí)間依賴(lài)性,在3天組致炎作用最強(qiáng),7天組的致炎作用卻有所降低。在24小時(shí)、3天組Nell-1對(duì)炎性因子的表達(dá)有明顯的抑制作用,在3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、7天組抑制作用不明顯。4、加入MAPK蛋白激酶抑制劑后發(fā)現(xiàn)ERK MAPK和p38 MAPK蛋白激酶抑制劑可明顯抑制Nell-1蛋白對(duì)IL-6、IL-8炎性因子表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)作用,JNK MAP蛋白激酶抑制劑對(duì)Nell-1的抑炎作用無(wú)明顯影響。結(jié)論：1、組織塊酶消化法培養(yǎng)牙髓細(xì)胞的方法操作步驟簡(jiǎn)單,培養(yǎng)出的牙髓原代細(xì)胞形態(tài)復(fù)雜多樣,經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)純化后的細(xì)胞外形形態(tài)均一、生長(zhǎng)狀態(tài)良好,增殖迅速,適宜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。2、用10ng/mlLPS成功建立了牙髓炎模型,Nell-1蛋白對(duì)牙髓細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)具有抑制作用,該抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。3、Nell-1對(duì)牙髓細(xì)胞炎性因子的抑制作用可能由MAPK信號(hào)通路中的ERK和p38信號(hào)共同參與調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R781.3

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3 莊Y，

本文編號(hào)：1175046