發(fā)布時間：2017-11-12 08:09

  本文關鍵詞：Nell-1對人牙髓細胞炎性因子表達的調節(jié)作用及其機制的體外研究

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【摘要】：目的：Nell-1蛋白(Nel-like molecule-1)是一種于顱縫早閉患者的早閉區(qū)發(fā)現的新型分泌蛋白。Nell-1對成骨細胞分化、礦化及骨的形成、再生有明顯的誘導作用。最新研究發(fā)現Nell-1蛋白可抑制BMP-2誘導的骨組織炎癥反應,減輕BMP-2在誘導骨形成時的副作用。牙體組織和骨組織在組織來源上具有同源性(均來源于神經嵴),基因結構上具有許多相似性,由此推測Nell-1蛋白可能參與調控牙髓炎中炎性因子的表達。本實驗擬通過體外實驗初步探索人重組Nell-1蛋白(簡稱Nell-1蛋白)對內毒素脂多糖(LPS)誘導的人牙髓細胞相關炎性因子(IL-6、IL-8)表達的調節(jié)作用及其可能的機制。材料和方法：1、利用酶消化組織塊法培養(yǎng)人牙髓原代細胞,用第4-6代牙髓細胞進行后續(xù)實驗。2、將人牙髓細胞與濃度分別為0、100、200、4OOng/ml的Nell-1蛋白及l(fā)Ong/mlLPS共培養(yǎng)24小時。并設立空白對照組。利用實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測IL-6、IL-8相關基因的表達,初步探索Nell-1對人牙髓細胞炎性因子表達的作用并確定Nell-1的最低有效作用濃度。3、利用Nell-1的最低有效作用濃度(200ng/m 1)和lOng/ml LPS共同作用人牙髓細胞,分別培養(yǎng)3小時、6小時、12小時、1天、3天、7天,利用qRT-PCR和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-6、IL-8在不同時間點上mRNA及蛋白表達情況。4、將人牙髓細胞與200ng/ml Nell-1蛋白、lOng/ml LPS、10μmol/L MAPK蛋白激酶抑制劑共培養(yǎng)24小時,通過qRT-PCR檢測IL-6、IL-8的mRNA表達情況。結果：1、利用組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出了牙髓原代細胞,進行傳代培養(yǎng)后獲得了狀態(tài)良好的牙髓細胞。2、用不同濃度梯度的Nell-1蛋白和10ng/mlLPS處理牙髓細胞24小時,發(fā)現10ng/mlLPS對牙髓細胞中IL-6、IL-8的表達具有明顯誘導作用(p0.01)。與對照組相比,200ng/mlNell-1蛋白可顯著抑制牙髓細胞中IL-6(p0.05)、IL-8(p0.01)的表達。3、用200ng/mlNell-1蛋白和10ng/mlLPS處理牙髓細胞3小時、6小時、12小時、24小時、3天、7天,發(fā)現LPS的致炎作用具有時間依賴性,在3天組致炎作用最強,7天組的致炎作用卻有所降低。在24小時、3天組Nell-1對炎性因子的表達有明顯的抑制作用,在3小時、6小時、12小時、7天組抑制作用不明顯。4、加入MAPK蛋白激酶抑制劑后發(fā)現ERK MAPK和p38 MAPK蛋白激酶抑制劑可明顯抑制Nell-1蛋白對IL-6、IL-8炎性因子表達的負調節(jié)作用,JNK MAP蛋白激酶抑制劑對Nell-1的抑炎作用無明顯影響。結論：1、組織塊酶消化法培養(yǎng)牙髓細胞的方法操作步驟簡單,培養(yǎng)出的牙髓原代細胞形態(tài)復雜多樣,經過傳代培養(yǎng)純化后的細胞外形形態(tài)均一、生長狀態(tài)良好,增殖迅速,適宜用于后續(xù)實驗研究。2、用10ng/mlLPS成功建立了牙髓炎模型,Nell-1蛋白對牙髓細胞中LPS誘導的炎性因子的表達具有抑制作用,該抑制作用具有劑量和時間依賴性。3、Nell-1對牙髓細胞炎性因子的抑制作用可能由MAPK信號通路中的ERK和p38信號共同參與調控。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.3

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本文編號：1175046