本文關(guān)鍵詞：小鼠牙齒損傷修復(fù)中Notch信號表達及其與細(xì)胞凋亡相關(guān)研究

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【摘要】：Notch信號通路通過相鄰細(xì)胞間Notch受體和配體的結(jié)合傳遞信號,調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,參與胚胎發(fā)育、器官形成和組織再生修復(fù)等過程。研究表明,Notch信號參與了牙齒發(fā)育過程,并在牙齒發(fā)育成熟后消失;但在牙髓損傷修復(fù)過程中,Notch信號被重新激活并主要表達于間充質(zhì)細(xì)胞,在成牙本質(zhì)細(xì)胞(Odontoblast,OB)中也有Notch信號的表達。牙髓損傷后牙髓間充質(zhì)細(xì)胞中的Notch信號激活被認(rèn)為是牙髓損傷修復(fù)過程中的早期分子事件,可能與促進牙髓損傷修復(fù)有關(guān)。OB細(xì)胞是牙髓組織中重要的功能細(xì)胞,是牙髓防御修復(fù)反應(yīng)中形成第三期牙本質(zhì)的執(zhí)行細(xì)胞;OB細(xì)胞受到致齲菌毒力因素或損傷刺激后發(fā)生凋亡,誘導(dǎo)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞向損傷部位遷移并分化為新的OB細(xì)胞,后者分泌牙本質(zhì)基質(zhì)繼而形成修復(fù)性牙本質(zhì)是牙髓損傷修復(fù)的基本模式。小鼠切牙具有一生不斷生長的特性,這使其成為研究牙齒損傷修復(fù)機制的良好模型。組織再生功能的維持依賴于干細(xì)胞的存在,而小鼠切牙牙根頂部的間充質(zhì)干細(xì)胞和頸環(huán)上皮干細(xì)胞的存在保證了小鼠切牙的不斷再生。研究發(fā)現(xiàn),小鼠切牙頸環(huán)有Notch信號的表達。那么,小鼠切牙的再生過程中是否有Notch信號的參與?當(dāng)小鼠切牙遭受機械損傷后,是否有Notch信號的激活表達和OB細(xì)胞凋亡變化?如果有,那么在損傷修復(fù)過程中Notch信號的激活與OB細(xì)胞凋亡是否存在聯(lián)系?目前尚未見文獻報道。因此,本課題通過建立小鼠切牙機械損傷的動物模型,研究在小鼠牙齒損傷修復(fù)中成釉器和牙髓組織Notch信號的表達以及OB細(xì)胞凋亡情況,并對OB細(xì)胞中的Notch信號和凋亡相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達情況進行了對比觀察分析,旨在進一步了解Notch信號在牙齒損傷修復(fù)中的作用,以期為牙齒損傷修復(fù)提供新思路。主要的研究結(jié)果如下:1.機械損傷對成釉器細(xì)胞Notch信號表達的影響利用牙科高速手機和金剛砂車針磨除小鼠下頜切牙牙冠切1/2的牙體組織建立小鼠切牙機械損傷模型,并于損傷后3d、5d和7d取材,進而制備石蠟組織切片;采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察Notch1、Notch2在小鼠切牙成釉器細(xì)胞中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Notch1、Notch2在正常小鼠切牙的成釉細(xì)胞中不表達,在中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中微弱表達,而機械損傷導(dǎo)致成釉器細(xì)胞Notch1、Notch2表達增強并呈現(xiàn)動態(tài)變化,表現(xiàn)為:在損傷后3d和5d,成釉細(xì)胞中出現(xiàn)了Notch1、Notch2的陽性表達,并且中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中Notch1、Notch2的表達均增強,其中以Notch2的表達增強更明顯;在損傷后7d,Notch1、Notch2的表達又逐漸減弱,表現(xiàn)為在成釉細(xì)胞中呈弱陽性表達或不表達,在中間層和星網(wǎng)狀層細(xì)胞中呈弱陽性表達。以上結(jié)果提示Notch信號可能參與成釉器細(xì)胞的功能調(diào)控,Notch信號激活與切牙的損傷修復(fù)有關(guān)聯(lián)。2.機械損傷對牙髓組織OB細(xì)胞Notch信號表達的影響利用牙科高速手機和和金剛砂車針磨除小鼠下頜切牙牙冠切1/2的牙體組織后,再用1/4#倒錐鉆在其遠中面頸部備洞至牙本質(zhì),建立小鼠切牙牙髓機械損傷模型,并于損傷后1d、3d、5d和7d取材,進而制備石蠟組織切片;采用免疫組織化學(xué)染色觀察Notch1、Notch2在牙髓OB細(xì)胞中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Notch1、Notch2在正常小鼠切牙的牙髓OB細(xì)胞中微弱表達,而機械損傷可上調(diào)OB細(xì)胞中Notch1、Notch2的表達并呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的動態(tài)變化,表現(xiàn)為:在損傷后1d,Notch1、Notch2呈陽性表達;在損傷后3d,Notch1、Notch2的表達進一步增強,呈強陽性表達;隨后表達逐漸減弱,在損傷后5d呈陽性表達;在損傷后7d呈弱陽性表達。以上結(jié)果提示Notch信號可能參與OB細(xì)胞的功能調(diào)控,Notch信號激活與牙髓組織的損傷修復(fù)有關(guān)聯(lián)。3.Notch信號激活與OB細(xì)胞凋亡的對比研究對第二部分實驗中所制備的石蠟組織切片進行TUNEL染色觀察OB細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常小鼠切牙的OB細(xì)胞層可見少量凋亡;在損傷后1d,近損傷區(qū)可見大量的凋亡細(xì)胞,OB細(xì)胞凋亡明顯;在損傷后3d,近損傷區(qū)的凋亡細(xì)胞明顯減少,僅見少量OB細(xì)胞凋亡;在損傷后5d和7d,OB細(xì)胞層均僅見少量凋亡。對比實驗二的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),牙髓損傷后OB細(xì)胞凋亡數(shù)量變化趨勢與Notch信號激活的動態(tài)變化趨勢相似,但二者的峰值時間不同,前者在損傷后1d,后者則在損傷后3d。因此我們推測,牙髓損傷后Notch信號激活可能與細(xì)胞凋亡調(diào)控存在一定聯(lián)系。為此,隨后我們進一步用免疫組織化學(xué)染色對OB細(xì)胞中Notch1、Notch2和抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白cleaved-Caspase-3的表達情況進行了對比觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在對照組,Notch1、Notch2均有微弱表達,Bcl-2不表達,cleaved-Caspase-3在少量細(xì)胞中呈弱陽性表達;在損傷后1d和3d,OB細(xì)胞Notch1、Notch2均呈明顯的陽性表達;Bcl-2在損傷后1d不表達,在損傷后3d呈弱陽性表達;cleaved-Caspase-3在對照組少量細(xì)胞中呈弱陽性表達,在損傷后1d其弱陽性表達的細(xì)胞數(shù)量有所增加,但在損傷后3d又明顯減少。對比Notch1、2和Bcl-2、cleaved-Caspase-3的表達變化情況,我們推測牙髓損傷后OB細(xì)胞中Notch信號和Bcl-2的激活可能參與細(xì)胞凋亡調(diào)控。通過以上實驗我們得出以下結(jié)論:1.機械損傷導(dǎo)致成釉器細(xì)胞的Notch信號被激活并呈動態(tài)變化,提示Notch信號可能參與小鼠切牙成釉器細(xì)胞的功能調(diào)控,從而參與調(diào)控切牙的損傷修復(fù)。2.Notch信號在正常小鼠切牙OB細(xì)胞中微弱表達,機械損傷后OB細(xì)胞出現(xiàn)先上調(diào)后下降的動態(tài)變化,提示Notch信號可能參與OB細(xì)胞的功能調(diào)控,從而參與牙齒的損傷修復(fù)過程。3.機械損傷可誘導(dǎo)OB細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡的數(shù)量變化趨勢與Notch信號激活的動態(tài)變化趨勢相似,提示Notch信號激活可能與細(xì)胞凋亡調(diào)控存在一定聯(lián)系;據(jù)進一步研究結(jié)果推測,Notch信號可能與抗凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)聯(lián),參與牙髓損傷后的OB細(xì)胞凋亡調(diào)控,但尚需進一步研究證實。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R780.2

【參考文獻】

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1 梁振興;楊陽;李悅;金振曉;王寧;易定華;段維勛;陳文生;;γ-分泌酶抑制劑對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系增殖凋亡的影響[J];臨床醫(yī)學(xué)工程;2012年06期

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本文編號：1170583