本文關鍵詞：GPNMB對體外人牙髓干細胞成牙本質分化的作用研究

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【摘要】：背景：牙髓在牙齒萌出以后的牙齒組織再生中起著極為重要的作用牙髓組織由外胚層間充質組成,其中含有具有可塑性和多向分化潛能的神經(jīng)嵴源性間充質祖細胞,即牙髓干細胞(DPSCs, dental pulp stem cells)。當牙體組織受到創(chuàng)傷和不可逆性的齲病損害時,牙髓干細胞會分化成新的成牙本質細胞分泌牙本質基質,即形成所謂的修復性牙本質。從人類健康的阻生第三磨牙可輕易獲得具有增殖潛能的牙髓干細胞,并且在特定條件下可以誘導表現(xiàn)為多能干細胞特點。在體外特定條件下,培養(yǎng)的牙髓干細胞具有分化成為成牙本質樣細胞的能力,表現(xiàn)為高的克隆能力、增殖能力和形成致密鈣化克隆團甚至是鈣化結節(jié)的能力。因此,研究認為牙髓干細胞可應用于牙體組織再生領域。牙齒的再生是由一個復雜的過程,眾多的細胞因子參與了該過程的調(diào)控�？缒し寝D移性黑色素瘤糖蛋白B (GPNMB, Glycoprotein (transmembrane) nonmetastatic melanoma protein b)是骨組織形成中的重要細胞因子。研究發(fā)現(xiàn),作為骨誘導因子,GPNMB可以促進骨組織形成和成骨細胞的分化。那么,GPNMB是否參與了調(diào)控牙髓干細胞成牙本質分化過程尚不清楚；如果GPNMB參與了調(diào)控牙髓干細胞成牙本質分化過程,其作用尚不明確。目的：本研究首先分離、培養(yǎng)及鑒定人牙髓干細胞；在此基礎上,探討人牙髓干細胞體外誘導成牙本質分化后GPNMB的表達；然后對牙髓干細胞轉染敲除GPNMB基因的siRNA,檢測GPNMB mRNA和蛋白表達和增殖能力以及礦化誘導后牙髓干細胞的ALP活性和礦化相關基因(DSPP和DMP-1)的表達,探討GPNMB在牙髓干細胞體外成牙本質分化的作用。從而為將來探討GPNMB在DPSCs成牙本質分化中的分子學機制及牙體牙髓損傷后修復和牙組織工程技術研究奠定分子生物學基礎。材料和方法：1.應用酶組織塊消化法從成人阻生的健康第三磨牙中分離獲得牙髓干細胞,并應用有限稀釋法對牙髓干細胞進行分離、培養(yǎng),經(jīng)細胞克隆形成實驗評價其細胞克隆能力,經(jīng)礦化誘導后ALP定量、茜素紅染色檢測成牙本質分化能力,經(jīng)成脂誘導后油紅0染色檢測成脂能力,PCR技術檢測人牙髓干細胞成牙本質分化特異性標志物DSPP和DMP-1。2.通過PCR技術和Western blot檢測GPNMB在人牙髓干細胞礦化誘導后成牙本質分化中的表達。3.運用RNA干擾技術,對牙髓干細胞轉染敲除GPNMB基因的siRNA,應用PCR技術和Western blot檢測GPNMB mRNA和蛋白的表達；及礦化誘導后牙髓干細胞的ALP活性和GPNMB礦化相關基因(DSPP和DMP-1)表達。結果：1.從成人阻生的健康第三磨牙牙髓組織成功分離、培養(yǎng)和鑒定人牙髓干細胞。 (1)細胞形態(tài)：培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細胞體積較小,相互間排列緊密,表現(xiàn)為典型的多形性特點,以長梭狀為主。(2)牙髓干細胞培養(yǎng)克隆形成計數(shù)為每1000個細胞有31～50clones,克隆形成率為3.1-5.0%。(3)ALP堿性磷酸酶染色：礦化誘導后7天、14天,與對照組相比ALP堿性磷酸酶染色陽性,堿性磷酸酶活性增強。(4)茜素紅染色：礦化誘導液誘導7天后鏡下可見牙髓干細胞中出現(xiàn)少量黃褐色結晶；至21天細胞呈復層生長,且見團塊狀紅褐色鈣化結節(jié)；定量分析顯示,7、14至21天礦化結節(jié)形成量隨時間延長逐漸增多,而未誘導組未見明顯礦化結節(jié)形成。(5)經(jīng)成脂誘導后,油紅0染色可見脂肪小滴形成。(6)牙髓干細胞誘導至1 4天成牙本質分化特異性標志物(DSPP、DMP-1)的表達,隨時間升高。2.牙髓干細胞礦化誘導第0、7、1 4天GPNMB mRNA的表達與GPNMB蛋白的表達明顯升高(p0.05)。3.培養(yǎng)的牙髓干細胞轉染敲除GPNMB基因的siRNA后,GPNMB mRNA和蛋白的表達明顯降低、增殖能力增強；而礦化誘導后牙髓干細胞的ALP活性和GPNMB礦化相關基因(DSPP和DMP-1)表達與實驗組相比明顯降低(p0.05),表明人牙髓干細胞成牙本質分化潛能下降。結論：1.從成人健康阻生的第三磨牙牙髓組織中可以分離出人牙髓干細胞,細胞的形態(tài)符合人牙髓干細胞形態(tài),并表現(xiàn)出良好的細胞克隆能力；經(jīng)培養(yǎng)鑒定表現(xiàn)出多向分化潛能,礦化誘導后表現(xiàn)出成牙本質分化潛能。2.GPNMB參與了人牙髓干細胞體外誘導成牙本質分化過程。3.GPNMB在調(diào)節(jié)人牙髓干細胞多向分化潛能中發(fā)揮重要作用,GPNMB的欠表達可以促進人牙髓干細胞的增殖、抑制人牙髓干細胞體外向成牙本質細胞的分化,因而GPNMB是成人牙髓干細胞體外成牙本質分化中重要的細胞因子。
【關鍵詞】：牙髓干細胞 成牙本質分化 細胞因子 GPNMB 細胞增殖
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R780.2
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 縮略語表14-16
• 研究背景16-19
• 第一章 GPNMB在體外人牙髓干細胞成牙本質分化中的表達19-49
• 1.1 材料19-21
• 1.1.1 儀器設備19
• 1.1.2 試劑與材料19-21
• 1.2 方法21-29
• 1.2.1 細胞來源21
• 1.2.2 人牙髓干細胞的分離與原代培養(yǎng)21
• 1.2.3 人牙髓干細胞的擴增及純化21-22
• 1.2.4 細胞克隆形成實驗22-23
• 1.2.5 堿性磷酸酶活性鑒定成牙本質細胞/成骨能力23
• 1.2.6 茜素紅染色與定量分析鑒定成牙本質細胞/成骨能力23-24
• 1.2.7 油紅0染色鑒定人牙髓干細胞成脂能力24
• 1.2.8 人牙髓干細胞特異分子標記物檢測24-26
• 1.2.9 GPNMR在人牙髓干細胞成牙本質分化過程中的表達26-29
• 1.2.10 統(tǒng)計分析29
• 1.3 結果29-32
• 1.3.1 細胞培養(yǎng)形態(tài)29-30
• 1.3.2 細胞克隆形成實驗30
• 1.3.3 堿性磷酸酶(ALP)測定30
• 1.3.4 茜素紅染色與定量分析30
• 1.3.5 成脂能力鑒定30
• 1.3.6 人牙髓干細胞特異分子標記物表達30
• 1.3.7 GPNMB在人牙髓干細胞成牙本質分化過程中的表達30-32
• 1.4 討論32-37
• 1.5 結論37-39
• 附圖39-49
• 第二章 siRNA-GPNMB對DPSCs成牙本質細胞分化的的作用49-65
• 1.1 材料49-51
• 1.1.1 儀器設備49
• 1.1.2 試劑與材料49-51
• 1.2 方法51-54
• 1.2.1 siRNA對人牙髓干細胞GPNMB表達的影響51-52
• 1.2.2 siRNA對人牙髓干細胞細胞增殖能力的影響52
• 1.2.3 siRNA對人牙髓干細胞細胞ALP活性的影響52-53
• 1.2.4 siRNA對人牙髓干細胞成牙本質分化相關基因表達的影響53
• 1.2.5 統(tǒng)計分析53-54
• 1.3 結果54-55
• 1.3.1 siRNA對人牙髓干細胞GPNMB表達的影響54
• 1.3.2 siRNA對人牙髓干細胞細胞增殖能力的影響54
• 1.3.3 siRNA對人牙髓干細胞細胞ALP活性的影響54
• 1.3.4 siRNA對人牙髓干細胞成牙本質分化相關基因表達的影響54-55
• 1.4 討論55-58
• 1.5 結論58-60
• 附圖60-65
• 參考文獻65-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄71-72
• 外文論文72-95
• 致謝95-97
• 學位論文評閱及答辯情況表97

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