發(fā)布時(shí)間：2017-10-22 08:28

  本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍通過miR-26a下調(diào)Mcl-1誘導(dǎo)人口腔癌細(xì)胞凋亡

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【摘要】：目的:以人口腔癌KB細(xì)胞為研究對(duì)象,研究二甲雙胍對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響,并探討二甲雙胍對(duì)細(xì)胞影響的初步作用機(jī)制。方法:1.細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍處理24 h后,在倒置顯微鏡下觀察KB細(xì)胞生長和形態(tài)學(xué)的變化。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,平板克隆觀察二甲雙胍對(duì)口腔癌細(xì)胞體外克隆形成能力的影響;2.KB細(xì)胞分組處理后,采用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化情況;Annexin V-FITC/PI染色方法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞凋亡的影響;Western blot檢測(cè)二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞內(nèi)Mcl-1,Bim,Bax及caspase-3蛋白的影響;3.cDNA Mcl-1上調(diào)Mcl-1后,MTT,JC-1觀察上調(diào)Mcl-1二甲雙胍對(duì)KB細(xì)胞增殖及凋亡的影響;Western blot法檢測(cè)口腔癌細(xì)胞中Mcl-1,Bim,Bax及caspase-3蛋白表達(dá)的變化;4.qRT-PCR檢測(cè)二甲雙胍處理KB細(xì)胞后miR-26a表達(dá)水平的變化;5.轉(zhuǎn)染miR-26a后,集落克隆實(shí)驗(yàn)和PI單染實(shí)驗(yàn)分別用于檢測(cè)KB細(xì)胞過表達(dá)miR-26a后,二甲雙胍對(duì)轉(zhuǎn)染mir-26a的KB細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響是否發(fā)生變化,隨后,再用蛋白印跡法檢測(cè)Mcl-1表達(dá)的變化。結(jié)果:1.不同濃度的二甲雙胍對(duì)人口腔癌KB細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響1)形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度二甲雙胍處理后,KB細(xì)胞可出現(xiàn)形態(tài)變圓,體積縮小,部分細(xì)胞發(fā)生邊集并破裂成細(xì)胞碎片等顯著的形態(tài)學(xué)變化。隨著二甲雙胍濃度的增加貼壁細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,漂浮細(xì)胞逐漸增多;2)MTT細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示,二甲雙胍可降低人口腔癌KB細(xì)胞的活力。與對(duì)照組相比,二甲雙胍處理組的細(xì)胞活力明顯降低,并呈現(xiàn)藥物濃度和時(shí)間依賴的關(guān)系;3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示二甲雙胍可顯著抑制kb細(xì)胞的克隆形成能力;4)annexinv-fitc/pi染色顯示二甲雙胍能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,并呈濃度依賴性。5)jc-1熒光檢測(cè),紅綠熒光的相對(duì)比例降低,提示線粒體膜電位下降;6)westernblot結(jié)果表明二甲雙胍能顯著下調(diào)口腔癌細(xì)胞中mcl-1的表達(dá),上調(diào)bim、bax的表達(dá)水平,并誘導(dǎo)caspase-3的活化。2.過表達(dá)mcl-1能夠降低口腔癌kb細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性1)cdnamcl-1轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)將cdnamcl-1和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入口腔癌細(xì)胞kb中,westernblot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染cdnamcl-1組中mcl-1表達(dá)明顯升高;2)cdnamcl-1轉(zhuǎn)染降低口腔癌細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性mtt結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染cdnamcl-1后kb細(xì)胞的存活率較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯提高,提示cdnamcl-1降低了kb細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性;jc-1結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染cdnamcl-1能抑制二甲雙胍引起的線粒體膜電位的下降。westernblot表明mcl-1的高表達(dá)抑制了kb細(xì)胞在二甲雙胍作用下細(xì)胞內(nèi)bax及bim蛋白的表達(dá)和caspase-3的活性。3.二甲雙胍對(duì)kb細(xì)胞mir-26a的調(diào)節(jié)及mir-26a對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響1)與對(duì)照組相比,二甲雙胍可明顯上調(diào)細(xì)胞中mir-26a的表達(dá)水平;2)用mir-26a的模擬物和抑制物分別轉(zhuǎn)染kb細(xì)胞,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mir-26a模擬物后,與二甲雙胍單獨(dú)處理組相比較,kb細(xì)胞的增殖受到明顯抑制,而mir-26a的抑制物則出現(xiàn)相反的結(jié)果。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),mir-26a的模擬物轉(zhuǎn)染kb細(xì)胞后,mcl-1水平明顯降低,且細(xì)胞凋亡率明顯增加。結(jié)論:1.二甲雙胍能顯著抑制kb細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;2.上調(diào)mcl-1后能降低口腔癌kb細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的敏感性;3.二甲雙胍刺激口腔癌KB細(xì)胞后上調(diào)miR-26a的表達(dá);4.二甲雙胍對(duì)口腔癌增殖及凋亡的影響可能與二甲雙胍上調(diào)miR-26a表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：口腔癌 二甲雙胍 凋亡 Mcl-1 miR-26a
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.8
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 引言11-13
• 材料與儀器13-16
• 方法16-28
• 結(jié)果28-38
• 討論38-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 致謝46-47
• 附錄A47-48
• 附錄B48-52
• 附錄C52-53
• 綜述53-60
• 參考文獻(xiàn)58-60

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本文編號(hào)：1077577