本文關(guān)鍵詞：ERK通路調(diào)控正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)牙周膜干細(xì)胞內(nèi)皮向分化的機(jī)制研究

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【摘要】：牙周炎作為常見(jiàn)的口腔慢性炎癥性疾病,常導(dǎo)致牙周支持組織破壞,進(jìn)而造成牙齒脫落,并可以影響一些全身性疾病的發(fā)病和病程。但是至今對(duì)于牙周炎發(fā)病及病程發(fā)展的機(jī)制尚不完全明確。牙周炎在發(fā)病過(guò)程中,炎性組織可以產(chǎn)生血管生成因子和炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)皮向分化,最終形成大量新生血管。現(xiàn)已證實(shí)牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化并形成血管的能力,但是對(duì)于調(diào)控其分化的胞內(nèi)機(jī)制尚不完全明確。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵通路之一,在真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,影響著細(xì)胞分裂增殖、分化、自噬、凋亡等多種生理病理行為。ERK1/2是ERK通路的關(guān)鍵蛋白,ERK1/2的磷酸化和去磷酸化是將分子信號(hào)從細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的關(guān)鍵步驟。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)因子刺激后,ERK1/2通過(guò)一系列酶反應(yīng)被激活,從而對(duì)細(xì)胞的活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。牙周膜干細(xì)胞在不同局部微環(huán)境下的多向分化能力是否發(fā)生變化、如何變化、受到什么因素或信號(hào)的調(diào)節(jié)、對(duì)生物學(xué)功能有何影響等已經(jīng)有一些研究報(bào)道,但主要集中于成骨分化方向;對(duì)其他方向分化可能及影響程度等尚少有研究。本課題針對(duì)于此,使用TNF-α模擬炎癥微環(huán)境,觀察ERK通路的活化對(duì)正常及炎癥微環(huán)境下PDLSCs內(nèi)皮向分化的調(diào)控作用;為進(jìn)一步深入探討不同分化方向能力變化和選擇性調(diào)控奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1研究目的:探討正常及炎癥微環(huán)境下,erk通路在pdlscs內(nèi)皮向分化中的作用,為pdlscs分化調(diào)控應(yīng)用提供理論依據(jù)。1.1體外培養(yǎng)和鑒定人牙周膜干細(xì)胞(hpdlscs)。使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,vegf)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,b-fgf)聯(lián)合誘導(dǎo)pdlscs內(nèi)皮向分化,檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)皮向分化相關(guān)的相關(guān)指標(biāo)水平,建立pdlscs內(nèi)皮向分化模型。在體外使用炎性因子tnf-α模擬體內(nèi)炎癥微環(huán)境對(duì)pdlscs進(jìn)行刺激,并檢測(cè)內(nèi)皮向分化相關(guān)指標(biāo),建立炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型。1.2按所建立正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)皮向分化模型,對(duì)pdlscs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo),檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖情況和內(nèi)皮向分化相關(guān)指標(biāo)水平。比較兩種不同誘導(dǎo)環(huán)境對(duì)pdlscs增殖和內(nèi)皮向分化的影響。1.3按照模型誘導(dǎo)pdlscs分化,觀察細(xì)胞內(nèi)erk1/2磷酸化水平隨不同時(shí)間點(diǎn)和誘導(dǎo)方法而發(fā)生的改變。1.4阻斷erk1/2磷酸化過(guò)程后,在正常及炎癥微環(huán)境對(duì)pdlscs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo),檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖情況和分化相關(guān)指標(biāo)水平。比較阻斷前后細(xì)胞分化能力的改變,明確erk通路對(duì)pdlscs內(nèi)皮向分化的作用。2研究方法:2.1采用酶消化法獲取原代牙周膜細(xì)胞,單細(xì)胞克隆純化細(xì)胞。克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的陽(yáng)性率,成骨及成脂誘導(dǎo)定性檢測(cè)細(xì)胞多向分化能力。2.2對(duì)兩種誘導(dǎo)環(huán)境下的pdlscs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo),real-timepcr檢測(cè)pdlscs誘導(dǎo)后內(nèi)皮相關(guān)基因cd31、vegf及ve-cadherinmrna的轉(zhuǎn)錄水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞中cd31+和ve-cadherin+細(xì)胞比例。matrigeltm基質(zhì)膠內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn),并拍照統(tǒng)計(jì)管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點(diǎn)數(shù)及管腔長(zhǎng)度。根據(jù)這些指標(biāo)比較正常及炎癥微環(huán)境pdlscs內(nèi)皮向分化能力的差異。2.3使用u0126作為erk1/2磷酸化阻斷劑,溶劑dmso作為陰性對(duì)照。提取pdlscs誘導(dǎo)后0h、1h、3h、6h、12h的蛋白,westernblotting檢測(cè)erk1/2磷酸化水平。正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)誘導(dǎo)以及加入u0126后分化誘導(dǎo)1h,提取蛋白檢測(cè)erk1/2磷酸化水平。2.4加入u0126阻斷erk1/2磷酸化過(guò)程,正常及炎癥微環(huán)境內(nèi)對(duì)pdlscs進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo),dmso作為陰性對(duì)照,real-timepcr檢測(cè)誘導(dǎo)后pdlscs內(nèi)皮相關(guān)基因cd31、vegf及ve-cadherinmrna轉(zhuǎn)錄水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞中cd31+和ve-cadherin+細(xì)胞比例;matrigeltm基質(zhì)膠內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn),并拍照統(tǒng)計(jì)管腔形成數(shù)目、分支節(jié)點(diǎn)數(shù)及管腔長(zhǎng)度并進(jìn)行比較。比較阻斷erk1/2磷酸化過(guò)程對(duì)pdlscs在兩種條件下內(nèi)皮向分化能力的差異。3研究結(jié)果:3.1原代培養(yǎng)純化后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,呈放射狀排列,長(zhǎng)軸之間近于平行。鑒定細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞具有克隆形成能力;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示純化所得細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物,低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物;成骨及成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞具有成骨和成脂分化潛能。3.2pdlscs內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)后檢測(cè)內(nèi)皮向分化指標(biāo),real-timepcr和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,對(duì)于炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)分化的pdlscs,ve-cadherin和vegfmrna轉(zhuǎn)錄水平、cd31+和ve-cadherin+細(xì)胞比例顯著高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下,管腔形成能力也明顯高于正常環(huán)境培養(yǎng)條件下內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)的pdlscs。3.3westernblotting顯示pdlscs經(jīng)過(guò)內(nèi)皮向分化誘導(dǎo),erk1/2磷酸化水平升高,其中1h和3h顯著高于誘導(dǎo)前。選取誘導(dǎo)后1h這一時(shí)間點(diǎn),分別在正常及炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)和加入u0126后進(jìn)行內(nèi)皮向分化誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)炎癥微環(huán)境中誘導(dǎo)的p-erk1/2水平高于正常條件下,而u0126可以阻斷誘導(dǎo)引起的erk1/2的磷酸化過(guò)程。3.4real-timepcr和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,加入u0126后,pdlscs的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)mrna轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平以及管腔形成能力均明顯降低,表明阻斷了erk1/2磷酸化過(guò)程會(huì)抑制pdlscs的內(nèi)皮向分化過(guò)程。但炎癥微環(huán)境中阻斷erk1/2磷酸化對(duì)內(nèi)皮向分化過(guò)程的抑制并不完全。結(jié)論:pdlscs被vegf和fgf誘導(dǎo)可以向內(nèi)皮細(xì)胞分化,這一過(guò)程受erk通路調(diào)控,阻斷erk通路可以抑制pdlscs的內(nèi)皮向分化。炎癥微環(huán)境下進(jìn)行分化誘導(dǎo)會(huì)促進(jìn)pldsc內(nèi)皮向分化過(guò)程,阻斷erk通路可以部分抑制pdlscs炎癥微環(huán)境下內(nèi)皮向分化過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：牙周膜干細(xì)胞 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 內(nèi)皮向分化 腫瘤壞死因子-α 炎性細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-18
• 文獻(xiàn)回顧18-30
• 實(shí)驗(yàn)一 內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)對(duì)牙周膜干細(xì)胞增殖的作用30-37
• 1 材料30-32
• 1.1 主要試劑30-31
• 1.2 主要器械和儀器31-32
• 2 方法32-33
• 2.1 臨床取材及細(xì)胞培養(yǎng)32
• 2.2 細(xì)胞純化32
• 2.3 細(xì)胞表面干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)32-33
• 2.4 多向分化誘導(dǎo)能力鑒定33
• 2.5 克隆形成率檢測(cè)33
• 2.6 統(tǒng)計(jì)方法33
• 3 結(jié)果33-36
• 3.1 牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)與純化33
• 3.2 PDLSCs細(xì)胞表面蛋白表達(dá)33-34
• 3.3 PDLSCs多向分化誘導(dǎo)34-35
• 3.4 克隆形成率35-36
• 4 討論36-37
• 實(shí)驗(yàn)二TNF-α上調(diào)PDLSCs的內(nèi)皮向分化能力37-49
• 1 材料37-38
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑37-38
• 1.2 主要儀器38
• 2 方法38-41
• 2.1 正常及炎癥微環(huán)境PDLSCs內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)38-39
• 2.2 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖39
• 2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)內(nèi)皮向分化相關(guān)基因表達(dá)39-41
• 2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮向分化蛋白表達(dá)41
• 2.5 MatrigelTM基質(zhì)膠管腔形成實(shí)驗(yàn)41
• 2.6 統(tǒng)計(jì)方法41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-45
• 3.1 TNF-α對(duì)PDLSCs誘導(dǎo)過(guò)程增殖的影響41-42
• 3.2 各組CD31、VEGF、VE-cadherin m RNA表達(dá)水平比較42-43
• 3.3 各組CD31、VE cadherin蛋白表達(dá)水平比較43-44
• 3.4 各組在MatrigelTM基質(zhì)膠內(nèi)的管腔形成率44-45
• 4 討論45-49
• 實(shí)驗(yàn)三ERK通路調(diào)控PDLSCs的內(nèi)皮向分化過(guò)程49-63
• 1 材料49-50
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑49-50
• 1.2 主要儀器50
• 2 方法50-52
• 2.1 細(xì)胞誘導(dǎo)并檢測(cè)分化能力50-51
• 2.2 提取細(xì)胞蛋白及蛋白定量51
• 2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ERK1/2 磷酸化水平51-52
• 2.4 各組內(nèi)皮向分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)52
• 2.5 統(tǒng)計(jì)方法52
• 3 結(jié)果52-61
• 3.1 阻斷ERK1/2 磷酸化過(guò)程對(duì)PDLSCs誘導(dǎo)過(guò)程增殖的影響52-53
• 3.2 內(nèi)皮向分化誘導(dǎo)上調(diào)了ERK1/2 的磷酸化水平53-54
• 3.3 TNF-α上調(diào)內(nèi)皮向分化過(guò)程ERK1/2 的磷酸化水平54-55
• 3.4 阻斷ERK1/2 磷酸化過(guò)程抑制PDLSCs誘導(dǎo)后CD31、VEGF、VE-cadherinmRNA表達(dá)55-56
• 3.5 阻斷ERK1/2 磷酸化過(guò)程抑制PDLSCs誘導(dǎo)后CD31、VEGF、VE-cadherin的蛋白表達(dá)56-59
• 3.6 阻斷ERK1/2 磷酸化過(guò)程抑制PDLSCs誘導(dǎo)后在Matrigel~(TM)基質(zhì)膠內(nèi)的管腔形成能力59-61
• 4 討論61-63
• 小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果69-70
• 致謝70-71

，

本文編號(hào)：1064130