本文關(guān)鍵詞：干細(xì)胞源性纖維軟骨自組裝基體的構(gòu)建及力學(xué)性能研究

  更多相關(guān)文章： 山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 組織工程 壓縮實(shí)驗(yàn) 顳下頜關(guān)節(jié)盤

【摘要】：類似于關(guān)節(jié)軟骨,關(guān)節(jié)盤缺損后難以自我修復(fù)。目前常規(guī)的手術(shù)治療可造成病人的持續(xù)性疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙,因此未來功能性顳下頜關(guān)節(jié)盤置換的發(fā)展是非常必要的。功能性修復(fù)關(guān)節(jié)盤組織因?yàn)榻M織工程技術(shù)的成熟發(fā)展而有了新的希望。在組織工程中,種子細(xì)胞—作為其理論中的三要素之一,對(duì)關(guān)節(jié)盤組織再生有著重要的影響。限于關(guān)節(jié)盤細(xì)胞高度分化性、體外培養(yǎng)迅速脫分化失去軟骨表型等特點(diǎn),直接利用關(guān)節(jié)盤細(xì)胞對(duì)缺損組織進(jìn)行修復(fù)面臨著細(xì)胞來源稀缺的難題。近年,間充質(zhì)干細(xì)胞的持續(xù)深入研究,啟發(fā)了研究者對(duì)關(guān)節(jié)盤組織工程種子細(xì)胞來源的新思路。基于干細(xì)胞的多向分化性,研究者試圖通過物理學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)等因素實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)并應(yīng)用于組織工程中。本次研究主要通過生長因子定向誘導(dǎo)及與山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞直接共培養(yǎng)兩種方法誘導(dǎo)并構(gòu)建自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體,同時(shí)改善并提高干細(xì)胞源性基體的力學(xué)性能,為成功構(gòu)建干細(xì)胞源性關(guān)節(jié)盤組織用于臨床修復(fù)打下基礎(chǔ)。本研究證明了直接共培養(yǎng)體系與生長因子定向誘導(dǎo)干細(xì)胞源性基體具有相似的力學(xué)性能,這為后期改善工程化關(guān)節(jié)盤的性能提供參考依據(jù)。內(nèi)容分為以下三個(gè)部分:第一部分percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法對(duì)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定比較;目的:比較percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度并評(píng)估其生物學(xué)特性,為后期實(shí)驗(yàn)摸清實(shí)驗(yàn)條件并提供大量細(xì)胞源。方法:無菌收取3-5月齡山羊股骨骨髓組織,分別采用percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法體外分離gBMSCs,相差顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài);取生長良好的P3代細(xì)胞,繪制細(xì)胞生長曲線;成纖維細(xì)胞集落形成單位實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其自我更新能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)。結(jié)果:兩組中原代及傳代細(xì)胞均呈漩渦狀排列生長,兩種分離方法獲得的P3代細(xì)胞“S”形生長曲線形態(tài)相似,全骨髓培養(yǎng)法分離的細(xì)胞在成纖維細(xì)胞集落形成能力中表現(xiàn)出更高的自我更新能力,流式結(jié)果顯示兩者表面標(biāo)志表達(dá)相似,其中CD34、CD44均呈陽性表達(dá),而CD45呈陰性。結(jié)論:不論密度梯度離心法還是全骨髓培養(yǎng)法,均可得到形態(tài)均一、具有自我更新潛力的gbmscs。但原代培養(yǎng)過程中密度梯度離心法提取的細(xì)胞增殖速度慢,到第3代時(shí)除細(xì)胞自我更新能力外其余細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯差異。第二部分tgf-β1、bmp-2聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體的影響;目的:誘導(dǎo)并構(gòu)建自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體,觀察其生物學(xué)特征并檢測(cè)力學(xué)性能,期望進(jìn)一步探索新的途徑用于顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程的成功構(gòu)建。方法:分離、培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,rt-qpcr檢測(cè)軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平;按5.5×106/井接種到預(yù)制瓊脂糖井內(nèi),每日更換誘導(dǎo)液(10ng/mltgf-β1,500ng/mlbmp-2,10-7mdex,1×its,50mg/lascorbicacid,40μg/mlproline,100μg/mlpyruvicacid,100u/mlpenicillin/100mg/mlstreptomycin)培養(yǎng)至42d;于14d、28d、42d時(shí)觀察和檢測(cè)自組裝gbmscs纖維軟骨基體形態(tài)、成分變化及基體抗壓縮力學(xué)性能。結(jié)果:經(jīng)過14d誘導(dǎo)后,誘導(dǎo)組rt-qpcr檢測(cè)軟骨相關(guān)基因(colⅠ、colⅡ、colⅩ、sox9、gag)的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(p0.01)。與之相反,oct-4表達(dá)水平在誘導(dǎo)組下降至對(duì)照組的19%(p0.01)。與對(duì)照組相比,14d、28d、42d時(shí)誘導(dǎo)組的組織學(xué)染色均顯示陽性,顯示基體分泌ecm糖胺多糖,14d、28d、42d時(shí)誘導(dǎo)組的Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性,顯示經(jīng)誘導(dǎo)后基體可產(chǎn)生作為原生自然關(guān)節(jié)盤組織的主要成分Ⅰ型膠原。壓縮實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組基體的壓縮模量均小于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)組基體的壓縮模量(p0.05);對(duì)于誘導(dǎo)組,42d時(shí)基體壓縮模量最大。結(jié)論:自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞纖維軟骨基體經(jīng)生長因子誘導(dǎo)成功構(gòu)建;基體經(jīng)誘導(dǎo)后分泌的ecm與自然關(guān)節(jié)盤相似,體外培養(yǎng)42d時(shí)壓縮模量最大。第三部分干細(xì)胞源性自組裝顳下頜關(guān)節(jié)盤復(fù)合基體的力學(xué)性能研究;目的:改善并提高干細(xì)胞源性自組裝基體的力學(xué)性能,為成功構(gòu)建干細(xì)胞源性關(guān)節(jié)盤組織用于臨床修復(fù)提供細(xì)胞組成篩選及力學(xué)參數(shù)。方法:分別構(gòu)建干細(xì)胞源性自組裝基體誘導(dǎo)組(10ng/mltgf-β1,500ng/mlbmp-2,10-7mdex,1×its,50mg/lascorbicacid,40μg/mlproline,100μg/mlpyruvicacid,100u/mlpenicillin/100mg/mlstreptomycin)和共培養(yǎng)組(gbmscs:tmjdisccells=2:1),體外培養(yǎng)42d后,觀察和檢測(cè)自組裝gbmscs纖維軟骨基體形態(tài)、成分變化、基體剖面形貌及基體抗壓縮力學(xué)性能。結(jié)果:體視顯微鏡鏡下觀察結(jié)果顯示除陰性對(duì)照組,其余各組基體呈類似規(guī)則球體,表面光滑連續(xù),具有光澤感且輕觸有回彈;除陰性對(duì)照組,其余各組組織學(xué)與免疫組織化學(xué)染色都成陽性,其中誘導(dǎo)組著色最深。說明各組自組裝基體可以分泌GAG及Ⅰ型膠原,且誘導(dǎo)組GAG和Ⅰ型膠原含量較共培養(yǎng)組高。掃描電鏡結(jié)果顯示自組裝基體相鄰細(xì)胞突觸接觸,細(xì)胞呈規(guī)則有序?qū)盈B排列,其中誘導(dǎo)組可見密集大量纖維同向排列呈一定走向,細(xì)胞多為層狀重疊分布;共培養(yǎng)組多為層狀細(xì)胞排列,但仍可見短而細(xì)的纖維分布。力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩組抗壓縮性能均高于關(guān)節(jié)盤自組裝基體對(duì)照組(P0.05),且誘導(dǎo)組抗壓縮性能明顯高于共培養(yǎng)組(P0.05)。結(jié)論:共培養(yǎng)體系構(gòu)建的自組裝基體具有與關(guān)節(jié)盤細(xì)胞自組裝基體相似的電鏡結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能,經(jīng)生長因子誘導(dǎo)后的干細(xì)胞自組裝基體力學(xué)性能明顯優(yōu)于前者,但其壓縮性能都不及原生關(guān)節(jié)盤組織。
【關(guān)鍵詞】：山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 組織工程 壓縮實(shí)驗(yàn) 顳下頜關(guān)節(jié)盤
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R782
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-15
• 第一部分 引言15-21
• 1.1 顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程15-17
• 1.1.1 組織工程概述15
• 1.1.2 顳下頜關(guān)節(jié)盤概述15
• 1.1.3 顳下頜關(guān)節(jié)盤的生物力學(xué)性能15-16
• 1.1.4 顳下頜關(guān)節(jié)盤組織工程的種子細(xì)胞16-17
• 1.1.5 工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤的相關(guān)研究17
• 1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞17-18
• 1.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化相關(guān)研究17-18
• 1.3 細(xì)胞共培養(yǎng)18-21
• 1.3.1 細(xì)胞共培養(yǎng)概述18
• 1.3.2 干細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的作用18-19
• 1.3.3 干細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)相關(guān)研究19-21
• 第二部分 不同方法下山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定21-31
• 2.1 概述21
• 2.2 材料與方法21-23
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象21
• 2.2.2 主要試劑21-22
• 2.2.3 主要設(shè)備22
• 2.2.4 主要溶液22-23
• 2.2.5 實(shí)驗(yàn)器材23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-26
• 2.3.1 gBMSCs分離與培養(yǎng)23-25
• 2.3.2 gBMSCs鑒定25-26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 2.4.1 gBMSCs形態(tài)學(xué)觀察26-28
• 2.4.2 gBMSCs成纖維細(xì)胞集落形成單位能力檢測(cè)28
• 2.4.3 gBMSCs表面標(biāo)記物表達(dá)28-29
• 2.5 討論29-30
• 2.6 小結(jié)30-31
• 第三部分TGF-β1、BMP-2 聯(lián)合誘導(dǎo)對(duì)自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基體的影響31-40
• 3.1 概述31
• 3.2 材料與方法31-32
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象31
• 3.2.2 主要試劑31-32
• 3.2.3 主要儀器32
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法32-35
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)分組32
• 3.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR, RT-qPCR）檢測(cè)成纖維軟骨相關(guān)基因表達(dá)32-33
• 3.3.3 自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基體構(gòu)建及誘導(dǎo)33-34
• 3.3.4 形態(tài)學(xué)觀察34
• 3.3.5 組織學(xué)染色34
• 3.3.6 免疫組織化學(xué)染色34
• 3.3.7 基體力學(xué)性能分析34-35
• 3.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法35
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-38
• 3.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR, RT-qPCR）檢測(cè)成纖維軟骨相關(guān)基因表達(dá)35-36
• 3.4.2 形態(tài)學(xué)觀察36
• 3.4.3 組織學(xué)染色36-37
• 3.4.4 免疫組織化學(xué)染色37
• 3.4.5 基體力學(xué)性能分析37-38
• 3.5 討論38-39
• 3.6 小結(jié)39-40
• 第四部分 干細(xì)胞源性纖維軟骨自組裝基體的力學(xué)性能研究40-47
• 4.1 概述40
• 4.2 材料與方法40
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象40
• 4.2.2 主要試劑40
• 4.3 實(shí)驗(yàn)材料40
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑40
• 4.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器40
• 4.3.3 主要溶液40
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 4.4.1 山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤的分離與細(xì)胞培養(yǎng)40-41
• 4.4.2 TMJ disc細(xì)胞的傳代培養(yǎng)41
• 4.4.3 gBMSCs分離與培養(yǎng)41
• 4.4.4 干細(xì)胞源性纖維軟骨自組裝基體的構(gòu)建41-42
• 4.4.5 形態(tài)學(xué)觀察42
• 4.4.6 組織學(xué)染色42
• 4.4.7 免疫組織化學(xué)染色42
• 4.4.8 SEM觀察基體剖面結(jié)構(gòu)42
• 4.4.9 基體力學(xué)性能分析42-43
• 4.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-45
• 4.5.1 形態(tài)觀察43
• 4.5.2 組織學(xué)染色43-44
• 4.5.3 免疫組織化學(xué)染色44
• 4.5.4 SEM觀察基體剖面結(jié)構(gòu)44-45
• 4.5.5 基體力學(xué)性能分析45
• 4.6 討論45-46
• 4.7 小結(jié)46-47
• 第五部分 結(jié)論與展望47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 在學(xué)期間研究成果52-53
• 致謝53-54
• 附錄54-63
• 1.1 RT-q PCR實(shí)驗(yàn)步驟54-55
• 1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-63

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1 趙云峰;母曉s，

本文編號(hào)：1029642