本文關(guān)鍵詞：全反式維甲酸對(duì)Aβ42誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD),是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化,日常生活能力進(jìn)行性減退,并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。據(jù)估計(jì)到2025年我國(guó)60歲以上老年人將達(dá)2.8億,占全國(guó)總?cè)丝诘?8.4%,屆時(shí)將有1009萬(wàn)的AD患者。隨著我國(guó)社會(huì)老齡化的日趨明顯和人均壽命的不斷提高,AD對(duì)人類(lèi)生命健康的威脅日益突出。 AD的特征性病理學(xué)特征包括,淀粉樣斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)、神經(jīng)元丟失、血管淀粉樣變性、炎癥性浸潤(rùn)以及氧化損傷等。有關(guān)AD發(fā)病機(jī)制的學(xué)說(shuō)眾多,如蛋白異常學(xué)說(shuō)、基因突變學(xué)說(shuō)、突觸功能紊亂學(xué)說(shuō)、線粒體功能紊亂學(xué)說(shuō)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、鈣平衡失調(diào)學(xué)說(shuō)等。Aβ產(chǎn)生與清除失衡,進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ蓄積和沉積形成淀粉樣斑塊,以及Aβ的神經(jīng)毒性是散發(fā)性AD最原始的病理因素之一。這也被稱之為淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)(amyloid cascade hypothesis),越來(lái)越遠(yuǎn)被廣大學(xué)者所接受。 可溶性Aβ的寡聚體和中間狀態(tài)的淀粉樣斑是Aβ具有神經(jīng)毒性的主要形態(tài)。Aβ40傾向形成神經(jīng)纖維,而Aβ42更易形成淀粉樣斑塊。淀粉樣斑塊易附著在AD腦組織的微血管壁上,引發(fā)腦血管淀粉樣病變,致使腦血管功能紊亂。另外Aβ的蓄積出現(xiàn)在tau蛋白蓄積之前,并促進(jìn)tau蛋白過(guò)度磷酸化,誘發(fā)或加速形成NFTs,擾亂軸突的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。Aβ可引起強(qiáng)烈的局灶性炎癥反應(yīng),活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集在淀粉樣斑塊和NFTs,并分泌大量的趨化因子和炎癥因子。Ap對(duì)線粒體有很強(qiáng)的毒性,尤其是它對(duì)突觸小泡的毒性。Ap寡聚體可抑制基礎(chǔ)性的突觸傳遞,以及減少樹(shù)突觸的數(shù)量,導(dǎo)致突觸的可塑性損傷。Aβ還能損傷煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)的信號(hào)傳導(dǎo),以及ACh從突觸前的末端釋放。 在AD患者腦內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn),淀粉樣斑塊周?chē)奂罅炕罨男切文z質(zhì)細(xì)胞。這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞在清除Aβ的過(guò)程中,起著非常重要的作用。體外研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)存活,而含有吞噬Ap的星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元混合培養(yǎng),則加速神經(jīng)元的死亡。星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化吞噬Aβ后,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂、能量代謝障礙、增加氧化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元死亡。 星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)內(nèi)源性免疫中起著非常重要的作用,與各類(lèi)神經(jīng)退行性疾病有著密切聯(lián)系。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以合成分泌各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng),保護(hù)神經(jīng)元的存活,維持腦內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以合成分泌APOE,促進(jìn)腦內(nèi)Ap的清除。 視黃酸(retinal acid,RA)是機(jī)體正常發(fā)育不可缺少的重要因子。RA通過(guò)激活其核受體,調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。RA信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育,細(xì)胞增殖、分化、凋亡,維持正常的免疫功能,以及神經(jīng)元的形成、存活。在腦內(nèi),RA受體主要分布于皮層和海馬等區(qū)域。大量研究表明,RA對(duì)于AD等神經(jīng)退行性疾病均有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與RA具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎作用、促進(jìn)α-分泌酶裂解APP、誘導(dǎo)APOE表達(dá)等相關(guān)。在腦內(nèi),RA受體主要分布于皮層和海馬等區(qū)域。大量研究表明,RA對(duì)于AD等神經(jīng)退行性疾病均有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與RA具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎作用、促進(jìn)α-分泌酶裂解APP、誘導(dǎo)APOE表達(dá)等相關(guān)。RA在體內(nèi)存在多種形式,但是在人體內(nèi)發(fā)揮重要作用的主要活性成分是ATRA。本課題擬研究RA的主要活性成分全反式維甲酸(ATRA)對(duì)Ap引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡是否具有抑制作用,進(jìn)而探討其相關(guān)的作用機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定 取出生1-2天的C57BL/6J乳鼠,分離大腦皮層。采用組織塊消化法進(jìn)行原代培養(yǎng),再利用差速貼壁技術(shù)分離純化星形膠質(zhì)細(xì)胞。采用GFAP、DAPI免疫組化共染細(xì)胞的方法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μg/ml的Aβ42,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。采用hoechst33258染色法,觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化。再加入0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的ATRA孵育24小時(shí),利用MTT法檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活率。 3. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1mRNA表達(dá)的影響 在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μg/ml的Aβ42,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。分別加入0.01μM、0.1μM\1μm、10μM的ATRA孵育24小時(shí),利用TRIzol法提取ATRA處理后的各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的總RNA,采用羅氏逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒,檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1mRNA的表達(dá)情況。 4. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1的影響 在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μg/ml的Aβ42,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。分別加入0.01μM、0.1μM、1μM、10μM的ATRA孵育24小時(shí),提取各組細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)各組細(xì)胞總蛋白濃度,再采用Western Blot法檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞中APOE、BACE1的蛋白表達(dá)情況。 5. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Ap清除的影響 在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2μg/ml的Aβ42,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。再加入1μM的ATRA孵育24小時(shí)。分別收集各組培養(yǎng)液和星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液和星形膠質(zhì)細(xì)胞中Ap含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用GFAP、DAPI共染細(xì)胞的方法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞純度95%。 2. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)hoechst33258染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化,研究發(fā)現(xiàn)Aβ42誘導(dǎo)加速細(xì)胞凋亡。不同濃度的ATRA對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡作用不同,其中0.1μM,1μM可以抑制Aβ42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,0.1μM、1μM ATRA能顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中APOE mRNA的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而對(duì)BACE1mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。 4. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比,Aβ42的處理能顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中APOE的蛋白表達(dá)；加入ATRA后,APOE的蛋白表達(dá)繼續(xù)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),然而ATRA對(duì)BACE1的蛋白表達(dá)無(wú)影響。 5. ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Aβ清除的影響 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,ATRA能顯著減少星形膠質(zhì)細(xì)胞(P0.01)及培養(yǎng)液(P0.05)中Ap含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 ATRA可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE表達(dá)上調(diào),增加星形膠質(zhì)細(xì)胞Ap清除率,抑制Aβ42誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡。低濃度ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有保護(hù)性作用。ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞BACE1表達(dá)無(wú)明顯影響。高濃度的RA具有一定的細(xì)胞毒性。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 星形膠質(zhì)細(xì)胞 ATRA APOE
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 第一部分 緒論14-26
• 1.1 阿爾茨海默病概述14
• 1.2 遺傳因素14-15
• 1.3 發(fā)病機(jī)理15
• 1.4 Aβ蛋白的產(chǎn)生和淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)15-17
• 1.5 Aβ蛋白的神經(jīng)毒性17-20
• 1.6 Aβ蛋白的清除20-21
• 1.7 視黃酸與阿爾茨海默病21-25
• 1.8 星形膠質(zhì)細(xì)胞與AD25-26
• 第二部分 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定26-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-32
• 2.4 小結(jié)32-33
• 第三部分 ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響33-39
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-37
• 3.4 小結(jié)37-39
• 第四部分 ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1 mRNA表達(dá)的影響39-47
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料39-40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法40-44
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-46
• 4.4 小結(jié)46-47
• 第五部分 ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞APOE、BACE1表達(dá)的影響47-59
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料47-52
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法52-57
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-58
• 5.4 小結(jié)58-59
• 第六部分 ATRA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ的影響59-62
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料59
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法59-60
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-61
• 6.4 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 討論63-66
• 參考文獻(xiàn)66-76
• 攻讀碩士期間成果76-77
• 致謝77-78

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：980701