本文關(guān)鍵詞：NGF和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)NSC分化及其在192-IgG-saporin致阿爾茨海默病模型鼠中的應(yīng)用

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【摘要】：研究背景：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，，其主要特征是進(jìn)行性的不可逆轉(zhuǎn)的記憶和認(rèn)知功能衰退，主要的病理學(xué)變化包括膽堿能神經(jīng)元丟失。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell, NSC)是一類非常重要的多潛能干細(xì)胞，有能力分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞移植治療以神經(jīng)元丟失為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有潛在的應(yīng)用前景。NSC在體外可以進(jìn)行神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)和單層貼壁培養(yǎng)，也可以在兩者之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。NSC分化機(jī)制非常復(fù)雜，而且受多方面因素的影響。研究表明，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)和腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)不但可以維持神經(jīng)元的生長和存活，還可以促進(jìn)NSC增殖并誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元。NGF和BDNF通過與NSC表面的受體Trk結(jié)合，激活MAPK/ERK信號通路，參與NSC的增殖分化調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化對NSC的增殖分化也有非常重要的調(diào)節(jié)作用。堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族中的HES1和HES5成員，有維持NSC增殖并抑制其分化的作用，另外的家庭成員如MASH1，NGN1和NeuroD則可促進(jìn)NSC分化。了解NSC的分化機(jī)制，主要是為了把NSC應(yīng)用于細(xì)胞移植代替療法治療神經(jīng)退行性疾病。研究表明，NSC移植可以改善受損神經(jīng)的功能，經(jīng)NGF或BDNF處理的NSC在移植后的存活和遷移能力都更高。 第一部分胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 目的建立NSC體外培養(yǎng)方案，使NSC在體外可以得到增殖和分化。方法無菌條件下取SD大鼠胚胎端腦，無血清懸浮培養(yǎng)，形成P2代神經(jīng)球后，將神經(jīng)球消化成單細(xì)胞，分為神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)和單層貼壁培養(yǎng)，并對兩種不同培養(yǎng)方式下的NSC進(jìn)行干性鑒定和分化能力鑒定。結(jié)果神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)和單層貼壁培養(yǎng)均可得到的NSC，單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞Nestin陽性率有93.17±3.06%；分化3d后，在不加入誘導(dǎo)因子的情況下，懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球β-tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞為11.91±2.73%，單層貼壁培養(yǎng)的NSC分化后β-tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞率為19.55±1.09%。結(jié)論先經(jīng)過兩代神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)化進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)的NSC更利于分化為神經(jīng)元。 第二部分NGF聯(lián)合BDNF對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的影響 目的研究單獨使用NGF或BDNF和兩個因子聯(lián)合應(yīng)用對神經(jīng)干細(xì)胞分化為 神經(jīng)元的影響，并探討可能的分子機(jī)制。方法將單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞分為四組，對照組，NGF組，BNDF組，BNDF和NGF聯(lián)合組。在誘導(dǎo)分化1d，3d，7d和14d時用免疫熒光技術(shù)檢測各組神經(jīng)元分化比例，用熒光定量PCR(Q-PCR)技術(shù)檢測HES1，HES5，MASH1，NGN1和NeuroD表達(dá)量的變化。在應(yīng)用MEK抑制劑PD98059處理細(xì)胞的情況下，蛋白免疫印跡(WB)技術(shù)用于檢測不同組MEK下游信號蛋白磷酸化的ERK(p-ERK)的水平變化。結(jié)果單獨使用NGF或BDNF都可以誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，誘導(dǎo)3d時神經(jīng)元比例分別為31%和35%，BDNF和NGF聯(lián)合誘導(dǎo)時，神經(jīng)元比例更高，誘導(dǎo)3d時約為39%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。WB結(jié)果表明，在使用和不使用MEK抑制劑PD98059的情況下，NGF組和BDNF組都比對照組p-ERK水平高，聯(lián)合組比NGF組和BDNF組的p-ERK水平高，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Q-PCR結(jié)果表明HES1和HES5在誘導(dǎo)分化后明顯降低，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；MASH1、NGN1和NeuroD表達(dá)在誘導(dǎo)分化后有明顯上升，聯(lián)合組比NGF組和BDNF組表達(dá)水平明顯提高，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論p-ERK，MASH1，NGN1和NeuroD的水平在各組間的變化差異與神經(jīng)元分化比例有著正相關(guān)的聯(lián)系，所有這些結(jié)果都表明聯(lián)合應(yīng)用NGF和BDNF可以提高對NSC分化為神經(jīng)元的影響，這為我們下一步的在體實驗提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 第三部分NGF和BDNF聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞在192-IgG-saporin致阿爾茨海默病模型鼠中的應(yīng)用 目的探討不同誘導(dǎo)方案下混合細(xì)胞的移植對192-IgG-saporin致AD模型動物的影響。方法將動物分為5組，假手術(shù)組，AD模型組，NGF組，BDNF組，聯(lián)合組。假手術(shù)組用等體積的生理鹽水代替192-IgG-saporin，動物建模3w后，用NGF，BDNF和聯(lián)合因子誘導(dǎo)NSC，將誘導(dǎo)3d后的混合細(xì)胞移植到受損動物的基底前腦，這3組動物簡稱為NGF組，BDNF組和聯(lián)合組。細(xì)胞移植4周后，水迷宮檢測不同組動物的學(xué)習(xí)記憶能力，免疫組織化學(xué)檢測不同組動物基底前腦膽堿能神經(jīng)元數(shù)量的改變和海馬突觸素的改變，組織化學(xué)方法檢測海馬AChE纖維的改變。結(jié)果模型組學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，細(xì)胞移植組可以明顯提高受損動物的學(xué)習(xí)記憶能力，其中聯(lián)合組第4d的逃避潛伏期縮短至8.87±0.26s，第5d空間搜索實驗穿越平臺次數(shù)為5.33±1.15次，與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；聯(lián)合組基底前腦膽堿能神經(jīng)元數(shù)量為96.00±6.20，恢復(fù)到假手術(shù)組的98.16%，海馬突觸素OD值恢復(fù)到假手術(shù)組的92.45%，AChE纖維數(shù)量恢復(fù)到假手術(shù)組的95.41%。結(jié)論用NGF和BDNF體外誘導(dǎo)NSC3d，再將混合細(xì)胞移植到受損動物，可以明顯提高受損動物的學(xué)習(xí)記憶能力，補(bǔ)充膽堿能神經(jīng)元數(shù)量，提高海馬突觸素和AChE纖維數(shù)量，聯(lián)合誘導(dǎo)比單因子誘導(dǎo)的效果更明顯。 總結(jié)： 1.將NSC先懸浮培養(yǎng)到P2代的神經(jīng)球，再轉(zhuǎn)化成單層貼壁培養(yǎng)，更利于NSC向神經(jīng)元方向分化。 2. NGF和BDNF聯(lián)合應(yīng)用比單獨應(yīng)用時可以誘導(dǎo)更多的NSC分化為神經(jīng)元，p-ERK，MASH1，NGN1和NeuroD的水平在各組間的變化差異與神經(jīng)元分化比例有著正相關(guān)的聯(lián)系，這些結(jié)果都表明聯(lián)合應(yīng)用NGF和BDNF可以提高對NSC分化為神經(jīng)元的影響，這為我們下一步的在體實驗提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 3.用NGF或(和)BDNF體外誘導(dǎo)NSC分化3d，再將混合細(xì)胞移植到模型鼠受損側(cè)的基底前腦，可以明顯提高受損動物的學(xué)習(xí)記憶能力，補(bǔ)充膽堿能神經(jīng)元數(shù)量，提高海馬突觸素和AChE纖維數(shù)量，聯(lián)合誘導(dǎo)比單因子誘導(dǎo)的效果更明顯。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細(xì)胞 神經(jīng)球 單層貼壁培養(yǎng) 分化 神經(jīng)生長因子 腦源性神經(jīng)生長因子 分化 堿性螺旋-環(huán)-螺旋 老年癡呆癥 水迷宮 膽堿能神經(jīng)元 突觸素 膽堿能纖維
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16;R-332
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 主要符號中英文對照表13-15
• 前言15-21
• 1 神經(jīng)干細(xì)胞及其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用15-16
• 2 NSC 可以在體外培養(yǎng)增殖16
• 3 影響 NSC 分化的因素16-19
• 3.1 神經(jīng)營養(yǎng)因子對 NSC 分化的影響16-17
• 3.2 MAPK/ERK 信號通路對 NSC 分化的影響17-18
• 3.3 轉(zhuǎn)錄因子對 NSC 分化的影響18-19
• 4 NSC 在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用前景19-20
• 5 本研究的立題依據(jù)和創(chuàng)新點20-21
• 第一部分 胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)21-33
• 1 材料和方法21-27
• 1.1 動物、主要試劑和儀器21-23
• 1.2 NSC 的取材、培養(yǎng)和傳代23
• 1.3 NSC 的分化23-24
• 1.4 NSC 的干性鑒定和分化能力鑒定24
• 1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光24-25
• 1.6 Q-PCR 步驟25-27
• 1.6.1 RNA 的提取25
• 1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈25-26
• 1.6.3 Q-PCR 反應(yīng)檢測基因表達(dá)26-27
• 1.7 統(tǒng)計學(xué)分析27
• 2 結(jié)果27-30
• 2.1 NSC 的培養(yǎng)和增殖及干性簽定27-28
• 2.2 NSC 的分化能力鑒定28-30
• 3 討論30-32
• 3.1 NSC 的體外培養(yǎng)方案30
• 3.2 影響 NSC 分化的因素30-31
• 3.3 NSC 體外培養(yǎng)的不足31
• 3.4 神經(jīng)球轉(zhuǎn)化為單層貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點31-32
• 4. 結(jié)論32-33
• 第二部分 NGF 聯(lián)合 BDNF 對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的影響33-56
• 1 材料和方法33-41
• 1.1 動物、主要試劑和儀器33-35
• 1.2 NSC 的取材和培養(yǎng)35
• 1.3 單獨使用 NGF 或 BDNF 和兩個因子的聯(lián)合應(yīng)用35-36
• 1.3.1 NGF 和 BDNF 濃度的確定35
• 1.3.2 因子的單獨使用和聯(lián)合應(yīng)用對 NSC 分化及相關(guān)分子改變的影響35-36
• 1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光36
• 1.5 Q-PCR 步驟36-37
• 1.6 總蛋白的提取和濃度測定37-38
• 1.6.1 細(xì)胞裂解提取總蛋白37
• 1.6.2 蛋白濃度測定37-38
• 1.7 蛋白免疫印跡38-41
• 1.7.1 WB 試劑準(zhǔn)備38-39
• 1.7.2 WB 分離膠和濃縮膠的制備39-40
• 1.7.3 WB 操作步驟40-41
• 1.8 統(tǒng)計學(xué)分析41
• 2 結(jié)果41-52
• 2.1 NGF 和 BDNF 誘導(dǎo)單層貼壁培養(yǎng) NSC 分化41-43
• 2.2 比較因子的單獨使用和聯(lián)合應(yīng)用對 NSC 分化的影響43-47
• 2.3 WB 檢測 PD98059 對 P-ERK 的水平變化和神經(jīng)元分化比例的影響47-49
• 2.4 Q-PCR 檢測 NGF 或(和)BDNF 對 bHLH 家庭基因的表達(dá)變化的影響49-52
• 3 討論52-54
• 3.1 NGF 和 BDNF 對 NSC 分化為神經(jīng)元的疊加作用52-53
• 3.2 ERK 的磷酸化參與 NGF 和 BDNF 對 NSC 的疊加作用53
• 3.3 MASH1、NGN1 和 NeuroD 的表達(dá)變化參與 NGF 和 BDNF 對 NSC 的疊加作用53-54
• 3.4 NSC 在細(xì)胞移植中的前景和挑戰(zhàn)54
• 4. 結(jié)論54-56
• 第三部分 NGF和BDNF聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞在192-IgG-saporin致阿爾茨海默病模型鼠中的應(yīng)用56-73
• 1 材料和方法56-62
• 1.1 動物、主要試劑和儀器56-57
• 1.2 SD 大鼠側(cè)腦室的 192-IgG-saporin 注射57-58
• 1.3 水迷宮行為學(xué)測試58-59
• 1.3.1 Morris 水迷宮實驗裝置58
• 1.3.2 定位航行實驗(隱藏平臺實驗)58-59
• 1.3.3 空間搜索實驗59
• 1.4 NSC 的培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化和移植59
• 1.5 動物的灌注及組織切片59-60
• 1.6 形態(tài)學(xué)檢測60-62
• 1.6.1 免疫組織化學(xué)檢測 p75NGFR受體和突觸素60
• 1.6.2 海馬切片 AChE 纖維染色60-61
• 1.6.3 切片脫水透明61-62
• 1.7 統(tǒng)計學(xué)分析62
• 2 結(jié)果62-70
• 2.1 Morris 水迷宮比較不同組之間的行為學(xué)差異62-64
• 2.2 膽堿能神經(jīng)元在不同組間的差別64-66
• 2.3 突觸素染色在不同組間的差別66-68
• 2.4 AChE 染色在不同組間的差別68-70
• 3. 討論70-72
• 3.1 192-IgG-saporin 致 AD 模型的建立70
• 3.2 NSC 對 AD 模型鼠的影響70-71
• 3.3 NGF 和 BDNF 聯(lián)合 NSC 對 AD 模型鼠的影響71-72
• 4 結(jié)論72-73
• 全文總結(jié)和展望73-74
• 參考文獻(xiàn)74-84
• 綜述84-91
• 參考文獻(xiàn)88-91
• 作者簡介91-94
• 附錄94-95
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果95-96
• 致謝96-97

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 潘學(xué)兵;龍大宏;羅秀梅;宣愛國;楊丹迪;冷水龍;李佳楣;;免疫毒素192-IgG-saporin側(cè)腦室注射建立阿爾茨海默病動物模型的實驗研究[J];解剖學(xué)研究;2006年01期

2 潘學(xué)兵;龍大宏;羅秀梅;楊丹迪;涂臘根;宣愛國;;神經(jīng)干細(xì)胞移植對192-IgG-saporin老年性癡呆模型鼠的學(xué)習(xí)記憶及海馬膽堿能纖維的影響[J];解剖學(xué)研究;2007年04期

3 賀小松;龍大宏;許孟杰;羅春云;劉菲菲;;Aβ(1-40)及192-IgG-saporin聯(lián)合作用對大鼠學(xué)習(xí)記憶以及海馬區(qū)錐體細(xì)胞和膽堿能纖維的影響[J];解剖學(xué)研究;2009年06期

4 丁道芳;邢三麗;周鳴鳴;宋后燕;;大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞單克隆化及單層化培養(yǎng)和鑒定[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2009年01期

5 羅秀梅;龍大宏;潘學(xué)兵;楊丹迪;宣愛國;李佳楣;;側(cè)腦室注射192-IgG-saporin致癡呆動物模型的實驗研究[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2006年06期

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7 扎拉嘎胡;張敏;陳莉;買霞;徐瑞成;;BDNF對大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年01期

8 潘學(xué)兵;龍大宏;羅秀梅;涂臘根;潘麗;王桂平;;神經(jīng)干細(xì)胞移植對192-IgG-saporin阿爾茨海默病模型鼠基底前腦神經(jīng)元p75~(NGFR)陽性神經(jīng)元和行為學(xué)的影響[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年45期

本文編號：907005