本文關(guān)鍵詞：24-脫氫膽固醇還原酶（DHCR24）相互作用蛋白的初步篩選研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's diseases, AD)是一種緩慢發(fā)展的臨床上以進(jìn)行性的認(rèn)知損害、記憶缺失和人格改變?yōu)樘卣鞯纳窠?jīng)退行性疾病,其與大腦及神經(jīng)組織中異常的膽固醇代謝有關(guān)。24-脫氫膽固醇還原酶(DHCR24)是人體合成膽固醇最終階段的酶,能夠催化鏈甾醇還原為膽固醇。阿爾茨海默病相關(guān)蛋白24-脫氫膽固醇還原酶(DHCR24)是一個(gè)廣泛表達(dá)的,兼具膽固醇合成功能以及抗細(xì)胞凋亡等多樣化生理功能的蛋白,其神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用得到公認(rèn),但其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的位置和功能尚未明確。為高通量篩選與DHCR24有相互作用的蛋白質(zhì),進(jìn)一步揭示DHCR24影響細(xì)胞命運(yùn)的分子機(jī)制,本次實(shí)驗(yàn)擬體外表達(dá)并純化獲得人源DHCR24蛋白,并在此基礎(chǔ)上聯(lián)合采用以DHCR24蛋白為誘餌的免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)及人腦cDNA文庫(kù)T7噬菌體展示技術(shù),初步篩選與DHCR24發(fā)生相互作用的候選蛋白。首先,我們以質(zhì)粒pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis為原料構(gòu)建質(zhì)粒PT7CFE1-HIS-DHCR24,通過(guò)蛋白體外表達(dá)系統(tǒng)得到過(guò)表達(dá)的DHCR24蛋白。利用免疫沉淀技術(shù)用已知可以和DHCR24相互作用的MDM2蛋白驗(yàn)證體外表達(dá)的DHCR24的功能；DHCR24功能得到確認(rèn)后,進(jìn)行免疫共沉淀聯(lián)合蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行分析,得到了部分可能與DHCR24相互作用的候選蛋白質(zhì)。另外,我們?cè)僖泽w外表達(dá)得到的DHCR24進(jìn)行蛋白包被,使用人腦cDNA文庫(kù)T7噬菌體展示技術(shù),篩選與DHCR24相互作用的蛋白質(zhì)。將兩部分得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,確定與DHCR24存在相互作用的候選蛋白質(zhì)。綜上所述,本論文以pT7CFEl-HIS-DHCR24重組質(zhì)粒的DHCR24蛋白體外蛋白表達(dá)及純化為基礎(chǔ),證明重組質(zhì)粒體外過(guò)表達(dá)的DHCR24具有良好的與其相互作用蛋白結(jié)合活性,并進(jìn)行了以DHCR24蛋白為誘餌蛋白的免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選DHCR24互作候選蛋白和噬菌體展示實(shí)驗(yàn)并初步確定了與DHCR24相互作用的候選蛋白,為進(jìn)一步研究DHCR24相互作用蛋白并理解DHCR24的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默病 DHCR24 噬菌體展示技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-12
• 引言12-17
• 0.1 DHCR24蛋白的發(fā)現(xiàn)12-13
• 0.2 DHCR24及其保護(hù)作用13-14
• 0.3 DHCR24與P53和MDM2之間的相互作用14
• 0.4 DHCR24拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),調(diào)整機(jī)制以及甲基化方面的研究14-15
• 0.5 蛋白互作篩選技術(shù)15
• 0.6 研究的目的意義15-17
• 第1章 重組質(zhì)粒PT7CFE1-His-DHCR24的構(gòu)建17-27
• 1.1 引言17-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 1.2.1 生化試劑耗材18
• 1.2.2 主要儀器設(shè)備18-19
• 1.2.3 試劑的配制19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法19-24
• 1.3.1 pcDNA3.1a-DHCR24和pT7CFE1-CHis質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增19-22
• 1.3.1.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化19-20
• 1.3.1.2 質(zhì)粒小量提取20-21
• 1.3.1.3 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證21
• 1.3.1.4 質(zhì)粒中提擴(kuò)增21-22
• 1.3.2 片段回收22-23
• 1.3.3 酶連重組23-24
• 1.3.4 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證和序列測(cè)定24
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論24-25
• 1.5 結(jié)論25-27
• 第2章 1-Step Human Coupled IVT Kit實(shí)現(xiàn)DHCR24體外表達(dá)及功能驗(yàn)證27-36
• 2.1 引言27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.2.1 生化試劑及耗材27-28
• 2.2.2 試劑的配制28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法28-33
• 2.3.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表達(dá)DHCR2428-29
• 2.3.2 Western Blot檢測(cè)DHCR24蛋白的表達(dá)29
• 2.3.3 免疫共沉淀驗(yàn)證表達(dá)DHCR24功能29-33
• 2.3.3.1 N2A細(xì)胞復(fù)蘇傳代、凍存30-31
• 2.3.3.2 DHCR24與MDM2的免疫共沉淀31-32
• 2.3.2.2 Western Blot檢測(cè)DHCR24與MDM2相互作用32-33
• 2.4 結(jié)果與討論33-35
• 2.4.1 1-Step Human Coupled IVT Kit-DNA表達(dá)DHCR24的驗(yàn)證33-34
• 2.4.2 Western Blot檢測(cè)DHCR24和MDM2蛋白的相互作用34-35
• 2.5 結(jié)論35-36
• 第3章 免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)篩選DHCR24互作蛋白36-55
• 3.1 引言36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 3.2.1 生化試劑及耗材36-37
• 3.2.2 試劑的配制37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法37-43
• 3.3.1 Ad293細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及總蛋白的提取37-39
• 3.3.1.1 Ad293細(xì)胞復(fù)蘇37-38
• 3.3.1.2 Ad293細(xì)胞傳代38
• 3.3.1.3 Ad293細(xì)胞凍存38
• 3.3.1.4 Ad293細(xì)胞總蛋白的提取38-39
• 3.3.2 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit表達(dá)DHCR2439-41
• 3.3.2.1 高效表達(dá)DHCR24蛋白39-40
• 3.3.2.2 BCA法測(cè)定表達(dá)DHCR24蛋白的濃度40
• 3.3.2.3 免疫共沉淀法沉淀DHCR24相互作用蛋白40-41
• 3.3.3 蛋白質(zhì)譜法檢測(cè)DHCR24相互作用蛋白41-43
• 3.3.3.1 免疫共沉淀樣本的考馬斯亮藍(lán)染色41-42
• 3.3.3.2 免疫共沉淀膠點(diǎn)蛋白的蛋白質(zhì)譜42
• 3.3.3.3 免疫共沉淀樣本全蛋白的蛋白質(zhì)譜42-43
• 3.4 結(jié)果與討論43-54
• 3.4.1 免疫共沉淀樣本考馬斯染色分析43
• 3.4.2 免疫共沉淀特異條帶質(zhì)譜分析43-44
• 3.4.3 免疫共沉淀全蛋白質(zhì)譜鑒定差異分析44-54
• 3.5 結(jié)論54-55
• 第4章 噬菌體展示技術(shù)篩選DHCR24相互作用蛋白55-66
• 4.1 引言55
• 4.1.1 噬菌體展示技術(shù)55
• 4.1.2 藍(lán)白斑篩選55
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料55-56
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法56-62
• 4.3.1 大腸桿菌BLT5403的擴(kuò)增和保存56-57
• 4.3.1.1 大腸桿菌BLT5403的復(fù)蘇56-57
• 4.3.1.3 大腸桿菌BLT5403的保存57
• 4.3.2 T7噬菌體的擴(kuò)增和保存57
• 4.3.3 噬菌體的滴度測(cè)定57-58
• 4.3.3.1 T7原始噬菌體滴度測(cè)定57-58
• 4.3.3.2 擴(kuò)增后的T7噬菌體滴度測(cè)定58
• 4.3.4 噬菌體展示技術(shù)可行性實(shí)驗(yàn)58-59
• 4.3.5 陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)59-60
• 4.3.6 DHCR24蛋白的包被和生物淘洗60-61
• 4.3.6.1 DHCR24蛋白的包被60
• 4.3.6.2 生物淘洗60-61
• 4.3.7 噬菌體篩選的PCR61
• 4.3.8 噬菌體篩選片段的TA克隆61-62
• 4.4 結(jié)果與討論62-65
• 4.4.1 人腦cDNA文庫(kù)T7噬菌體的初始濃度測(cè)定結(jié)果62
• 4.4.2 人腦cDNA文庫(kù)T7噬菌體的擴(kuò)增后的濃度測(cè)定結(jié)果62
• 4.4.3 噬菌體展示技術(shù)可行性實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-63
• 4.4.4 噬菌體展示陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果63
• 4.4.5 生物淘洗過(guò)程中的噬菌體滴度測(cè)定結(jié)果63-64
• 4.4.6 噬菌體篩選的PCR64-65
• 4.5 結(jié)論65-66
• 第5章 結(jié)果與展望66-68
• 致謝68-69
• 參考文獻(xiàn)69-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文及參加科研情況71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 宋銘晶;董偉;全雄志;施海霞;黃瀾;張連峰;;心臟特異表達(dá)Dhcr24轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和表型分析[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2008年05期

2 譚來(lái)勛;孫圣剛;張雙國(guó);;不同發(fā)育時(shí)期大鼠腦海馬區(qū)膽固醇對(duì)發(fā)育與成熟的意義(英文)[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年36期

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本文編號(hào)：891889