發(fā)布時間：2017-09-07 05:40

  本文關(guān)鍵詞：β-淀粉樣蛋白纖維結(jié)構(gòu)的固體核磁共振研究

  更多相關(guān)文章： 阿爾茲海默癥 β-淀粉樣蛋白纖維 固體核磁共振 魔角旋轉(zhuǎn)

【摘要】：阿爾茲海默癥俗稱老年癡呆癥,其主要的病理特征是淀粉樣蛋白斑和神經(jīng)纖維結(jié)。淀粉樣蛋白斑的主要成分是p-淀粉樣蛋白質(zhì),其纖維化過程伴隨著蛋白質(zhì)與膜的相互作用,因此解析磷脂雙層膜環(huán)境下的纖維結(jié)構(gòu)對于β-淀粉樣蛋白質(zhì)的聚集機理,以及阿爾茲海默癥病理病因的深層次認知具有重要的研究意義。 固體核磁共振技術(shù)可以在磷脂膜環(huán)境下解析淀粉樣蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)以及纖維化的動力學(xué)過程,近年來成為研究此類蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的有力手段。 本研究運用原核表達技術(shù)在大腸桿菌細胞中表達出Aβ1-40蛋白,運用離子交換層析和凝膠過濾層析技術(shù),成功制備出高純度的Aβ1-40蛋白,進而在溶液環(huán)境和DMPC/DMPG磷脂雙層膜環(huán)境下孵育出Aβ1-40蛋白纖維。結(jié)合電泳技術(shù)、圓二色光譜、ThT熒光光譜和電子顯微鏡對Ap蛋白的纖維化過程進行初步表征,其中圓二色光譜主要用于檢測纖維化過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化；ThT熒光光譜用于監(jiān)測蛋白質(zhì)纖維化的動力學(xué)過程；電子顯微鏡可以直觀地提供纖維的外貌形態(tài)信息。最終結(jié)合固體核磁共振魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù),解析出DMPC/DMPG磷脂囊泡環(huán)境下具有原子分辨率的Aβ1-40的分子結(jié)構(gòu)。 本論文提出的DMPC/DMPG磷脂環(huán)境下的Aβ1-40的三維結(jié)構(gòu)是近年來第一個在磷脂囊泡中得到的具有高分辨率的結(jié)構(gòu)。同時以溶液環(huán)境下的Aβ1-40的纖維化過程為參照,從膜的成分、帶電荷情況、蛋白磷脂比例和纖維化過程中蛋白質(zhì)的起始濃度四個方面分析討論了膜對Aβ蛋白纖維化過程的影響�？傊�,我們不僅說明了蛋白磷脂相互作用是如何加速Ap的纖維化過程,影響Ap的分子結(jié)構(gòu),而且進一步證明了Ap纖維化過程的復(fù)雜性和分子結(jié)構(gòu)的多樣性。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默癥 β-淀粉樣蛋白纖維 固體核磁共振 魔角旋轉(zhuǎn)
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院（武漢物理與數(shù)學(xué)研究所）
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：O657.2;R749.16
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-6
• ABSTRACT6-7
• 目錄7-10
• 第一章 引言10-23
• 1.1 阿爾茲海默癥簡介10-11
• 1.2 β-淀粉樣蛋白質(zhì)簡介11-13
• 1.3 Aβ和細胞膜的相互作用13-15
• 1.3.1 陰離子型磷脂對Aβ與細胞膜相互作用的影響13-14
• 1.3.2 蛋白磷脂比例對Aβ與細胞膜相互作用的影響14
• 1.3.3 磷脂成分對Aβ與細胞膜相互作用的影響14-15
• 1.4 固體核磁共振解析淀粉樣蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)15-21
• 1.4.1 固體核磁共振技術(shù)的優(yōu)勢15-16
• 1.4.2 同位素標記策略16
• 1.4.3 Aβ寡聚體結(jié)構(gòu)的固體核磁共振研究16-17
• 1.4.4 Aβ纖維結(jié)構(gòu)的固體核磁共振研究17-21
• 1.5 本文的研究意義與研究內(nèi)容21-23
• 第二章 原理與材料23-29
• 2.1 質(zhì)粒構(gòu)建23-24
• 2.2 蛋白質(zhì)表達純化24-25
• 2.2.1 離子交換層析24-25
• 2.2.2 凝膠過濾層析25
• 2.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳25
• 2.3 淀粉樣蛋白纖維的檢測25-27
• 2.3.1 圓二色光譜25-26
• 2.3.2 熒光光譜26-27
• 2.4 儀器和試劑27-29
• 第三章 Aβ_(1-40)纖維樣品的制備與表征29-56
• 3.1 前言29
• 3.2 質(zhì)粒構(gòu)建29-33
• 3.2.1 引物設(shè)計與擴增29-30
• 3.2.2 瓊脂糖凝膠電泳30-31
• 3.2.3 PCR產(chǎn)物膠回收31
• 3.2.4 載體質(zhì)粒提取31-32
• 3.2.5 雙酶切與連接32-33
• 3.2.6 轉(zhuǎn)化和重組子的篩選與鑒定33
• 3.3 表達純化33-39
• 3.3.1 表達與優(yōu)化33-35
• 3.3.2 蛋白質(zhì)純化35-38
• 3.3.3 標記蛋白的表達38-39
• 3.4 溶液環(huán)境中Aβ_(1-40)纖維樣品的制備及初步表征39-43
• 3.4.1 纖維化前Aβ_(1-40)預(yù)處理39-41
• 3.4.2 Aβ_(1-40)蛋白纖維化進程摸索41
• 3.4.3 Aβ_(1-40)蛋白纖維PAGE41
• 3.4.4 圓二色光譜檢測二級結(jié)構(gòu)變化41-43
• 3.4.5 ThT熒光光譜監(jiān)測纖維化進程43
• 3.4.6 TEM觀察纖維外貌特征43
• 3.5 膜環(huán)境下Aβ_(1-40)纖維樣品的制備及初步表征43-46
• 3.5.1 DMPC/DMPG混合型磷脂中Aβ_(1-40)纖維樣品制備43-44
• 3.5.2 DMPC/DMPG混合型磷脂中Aβ_(1-40)纖維PAGE44
• 3.5.3 圓二色光譜檢測二級結(jié)構(gòu)變化44-45
• 3.5.4 ThT熒光光譜監(jiān)測纖維化進程45-46
• 3.5.5 TEM觀察纖維外貌特征46
• 3.6 膜對Aβ_(1-40)纖維化過程的影響46-55
• 3.6.1 磷脂膜環(huán)境對纖維化過程的影響46-50
• 3.6.2 蛋白磷脂比例對纖維化過程的影響50-53
• 3.6.3 磷脂膜所帶負電荷對纖維化過程的影響53-54
• 3.6.4 蛋白起始濃度對纖維化過程的影響54-55
• 3.7 小結(jié)55-56
• 第四章 Aβ_(1-40)纖維的三維結(jié)構(gòu)56-66
• 4.1 前言56
• 4.2 核磁共振樣品的初步表征56-58
• 4.3 化學(xué)位移指認與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測58-62
• 4.3.1 DMPC/DMPG磷脂環(huán)境下Aβ_(1-40)纖維樣品的二級結(jié)構(gòu)58-59
• 4.3.2 溶液環(huán)境下Aβ_(1-40)纖維樣品的二級結(jié)構(gòu)59-61
• 4.3.3 二級結(jié)構(gòu)對比61-62
• 4.4 距離約束測量62-63
• 4.5 三維結(jié)構(gòu)計算63-64
• 4.6 小結(jié)64-66
• 第五章 總結(jié)與展望66-69
• 5.1 總結(jié)66
• 5.2 展望66-69
• 參考文獻69-74
• 附錄74-83
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果83

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本文編號：807735