本文關(guān)鍵詞：精神分裂癥患者iPSCs模型及神經(jīng)細(xì)胞模型的建立

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【摘要】：背景精神分裂癥(schizophrenia,SZ)是一種高度遺傳性的多因子共同作用的嚴(yán)重精神類疾病,多發(fā)于青少年時(shí)期。由于疾病模型的缺乏,至今未了解其發(fā)病機(jī)制。從iPSCs誘導(dǎo)分化為各類神經(jīng)細(xì)胞或者直接將體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞,為從體外研究供體神經(jīng)細(xì)胞的分子事件以及研究神經(jīng)發(fā)育過程提供了基礎(chǔ)。目的本研究旨在構(gòu)建SZ患者的細(xì)胞模型。首先,通過慢病毒介導(dǎo)的重編程因子將SZ患者的皮膚成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblasts,HDF)重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs);其次,通過神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子組合將HDF直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞,由此建立SZ的iPSCs及神經(jīng)細(xì)胞模型。方法1.重編程因子的慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建,用PCR的方法從質(zhì)粒pEP4EO2SEM2K上擴(kuò)增重編程因子組合OCT4-IRES2-SOX2和C-MYC-IRES2-KLF4,將其連接入慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry。并通過酶切、鏈接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等得到重組質(zhì)粒pLVXOCT4-IRES2-SOX2和pLVX-C-MYC-IRES2-KLF4。2.神經(jīng)誘導(dǎo)相關(guān)因子慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建,用PCR的方法從人類全血cDNA上擴(kuò)增ASCL1、BRN2、MYT1L片段將其連接入慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry。并通過酶切、鏈接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等得到重組質(zhì)粒pLVX-ASCL1、pLVX-BRN2、pLVX-MYT1L。3.重組慢病毒制備與侵染效率分析。重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pMD2.G和pSPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,濃縮超濾收集慢病毒,取濃度梯度侵染293T細(xì)胞檢測(cè)侵染活力,確定侵染目的細(xì)胞的病毒用量。4.從SZ患者HDF細(xì)胞誘導(dǎo)iPSCs及其鑒定。用侵染活力良好的pLVXOCT4-IRES2-SOX2和pLVX-C-MYC-IRES2-KLF4病毒顆粒組合侵染患者HDF細(xì)胞,待克隆形成后,用RT-PCR和Western blotting鑒定誘導(dǎo)克隆是否為iPSCs。5.從SZ患者HDF細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞及其鑒定。用侵染活力良好的pLVX-ASCL1、pLVX-BRN2、pLVX-MYT1L病毒顆粒組合侵染患者HDF細(xì)胞,待神經(jīng)樣細(xì)胞形成后,用RT-PCR和免疫熒光法鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞是否為神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)果1.測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了誘導(dǎo)iPSCs的重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-OCT4-IRES2-SOX2(OCT4/SOX2)、pLVX-C-MYC-IRES2-KLF4(C-MYC/KLF4);成功構(gòu)建了誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)因子重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-ASCL1、pLVX-BRN2、pLVX-MYT1L。分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后成功包裝出5種有侵染活力的慢病毒。2.將一例精神分裂癥患者HDF細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs,并且對(duì)誘導(dǎo)克隆進(jìn)行了鑒定。3.將一例精神分裂癥患者HDF細(xì)胞誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞,并對(duì)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。結(jié)論從精神分裂癥患者的HDF細(xì)胞出發(fā),將精神分裂癥患者的HDF細(xì)胞去分化為iPSCs和轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞,為本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)建立更多SZ細(xì)胞模型及其發(fā)病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 直接轉(zhuǎn)分化技術(shù) 精神分裂癥 神經(jīng)細(xì)胞 細(xì)胞模型
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 1 材料和方法11-36
• 2 結(jié)果與分析36-48
• 3 討論48-50
• 4 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 綜述：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)在帕金森病研究中的進(jìn)展54-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況64-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66

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1 任佩佩;精神分裂癥患者iPSCs模型及神經(jīng)細(xì)胞模型的建立[D];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院;2016年

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本文編號(hào)：788350