本文關(guān)鍵詞：嗎啡調(diào)節(jié)硫氧還蛋白表達的分子途徑

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【摘要】：藥物成癮(Drug addiction)通常是指由于長期大量使用某種或多種精神活性藥物而形成的一種慢性復發(fā)性腦病,其主要特征為機體出現(xiàn)強迫性用藥、強迫性覓藥,以及行為控制障礙等行為改變。 嗎啡成癮已成為困擾人類的世界性難題,然而其成癮的機制尚不完全清楚。研究表明,嗎啡可引起細胞內(nèi)信號分子如細胞周期依賴性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase5, CDK5)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein, CREB)及Ca2+相關(guān)分子等改變,這些分子在嗎啡依賴形成及戒斷綜合征的產(chǎn)生中起十分重要的作用。CDK5是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,屬于細胞周期依賴性蛋白激酶家族,但目前未發(fā)現(xiàn)其與細胞周期調(diào)控作用相關(guān)。在嗎啡成癮的研究中,CDK5可使嗎啡受體的delta受體發(fā)生磷酸化,延緩了嗎啡的耐受。CDK5還參與了成癮過程中多巴胺信號的調(diào)節(jié)。CREB在藥物成癮中起著重要作用,是目前為止研究最深入的成癮相關(guān)分子之一。CREB的第133位絲氨酸殘基(Ser133)被磷酸化后就成為活性狀態(tài),即p-CREB。p-CREB可參與多種基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),誘導細胞內(nèi)的多種生物學效應(yīng)。阿片類藥物可以誘導p-CREB的產(chǎn)生,形成藥物依賴。NR2B是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體的一個亞基,在突觸可塑性(Synaptic plasticity)和學習記憶過程中起著重要作用。NR2B高表達的轉(zhuǎn)基因小鼠比普通小鼠表現(xiàn)出更強的學習記憶能力。藥物成癮的發(fā)生是一種病理性學習記憶的形成過程,因此,NR2B與成癮密切相關(guān)。Ca2+是細胞內(nèi)重要的第二信使,在嗎啡成癮中扮演著重要角色,使用鈣離子通道阻滯劑可消除嗎啡類藥物依賴動物的戒斷癥狀,長期接觸嗎啡類物質(zhì)可使神經(jīng)細胞膜中的鈣離子通道增多。NMDA受體、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)是細胞內(nèi)重要的Ca2+調(diào)控分子,在Ca2+的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。 此外,嗎啡成癮還可導致氧化應(yīng)激以及氧化還原平衡狀態(tài)的失調(diào)。硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)是一種能調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的小分子蛋白質(zhì),其分子量約為12KDa,具有多種功能,廣泛存在于原核、真核生物中。它與硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin reductase, TrxR)、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng),在機體內(nèi)參與多種生理過程,發(fā)揮抗氧化、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等作用。因此,在本文中,我們選用NMDAR/CaMKⅡ/ERK通路的阻滯劑研究嗎啡在PC12細胞中調(diào)節(jié)Trx的變化情況。 本研究中,我們采用低分化的PC12細胞為研究對象,探索嗎啡對Trx作用的相關(guān)機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),一定劑量的嗎啡可以誘導細胞內(nèi)Trx的表達。我們還發(fā)現(xiàn)NMDA受體的抑制劑MK-801, CaMKⅡ的抑制劑KN-62及ERK的抑制劑PD98059,可以阻斷嗎啡對Trx的誘導作用。此外,相同劑量的嗎啡可抑制細胞內(nèi)p-CREB的表達,而小鼠體內(nèi)實驗與細胞實驗結(jié)果一致,高表達的Trx同樣可以阻斷嗎啡引起的p-CREB表達的抑制。另外,嗎啡可以抑制CDK5的表達。有趣的是Trx轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)NR2B表達的升高。 總結(jié)：本課題研究了一定劑量的嗎啡可以誘導Trx的表達并抑制CDK5和p-CREB的表達,NMDA受體的抑制劑MK-801, CaMKⅡ的抑制劑KN-62及ERK的抑制劑PD98059抑制嗎啡誘導的Trx,初步闡明了嗎啡誘導Trx表達的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑。高表達的Trx可阻斷嗎啡對p-CREB的抑制作用,并可誘導小鼠海馬區(qū)NR2B的表達,提示Trx在嗎啡成癮中可能發(fā)揮一定的作用。因此,進一步研究嗎啡與Trx的相關(guān)性,可能為藥物成癮的治療提供新的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：嗎啡 硫氧還蛋白 CDK5 CREB 藥物成癮
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.61
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• ~.略語索引14-16
• 第一章 緒論16-33
• 1.1 藥物成癮16-21
• 1.1.1 藥物成癮簡介16
• 1.1.2 藥物成癮的機制16-20
• 1.1.3 嗎啡20-21
• 1.2 硫氧還蛋白21-26
• 1.2.1 硫氧還蛋白簡介21-22
• 1.2.2 硫氧還蛋白的生物學功能22-24
• 1.2.3 硫氧還蛋白與藥物成癮24-26
• 1.3 CDK526-28
• 1.3.1 CDK5簡介26-27
• 1.3.2 CDK5與藥物成癮27-28
• 1.4 CREB/p-CREB28-29
• 1.4.1 CREB/p-CREB簡介28-29
• 1.4.2 CREB/p-CREB與藥物成癮29
• 1.5 蛋白免疫印跡29-31
• 1.5.1 蛋白免疫印跡原理29-31
• 1.5.2 蛋白質(zhì)免疫印記基本操作流程31
• 1.6 本論文研究的目的及意義31-33
• 第二章 嗎啡對硫氧還蛋白表達的影響及其信號通路研究33-49
• 2.1 引言33-34
• 2.2 實驗方案34
• 2.3 實驗材料34-39
• 2.3.1 實驗細胞及藥物34
• 2.3.2 主要試劑34-36
• 2.3.3 主要儀器設(shè)備36-37
• 2.3.4 主要試劑的配制37-39
• 2.4 實驗方法39-43
• 2.4.1 細胞培養(yǎng)39-40
• 2.4.2 細胞排板與藥物刺激40
• 2.4.3 提取細胞總蛋白40-41
• 2.4.4 蛋白免疫印跡41-43
• 2.4.5 統(tǒng)計學處理43
• 2.5 實驗結(jié)果43-46
• 2.5.1 嗎啡對Trx最佳作用濃度的確定43-44
• 2.5.2 MK-801阻斷了嗎啡對硫氧還蛋白的誘導44-45
• 2.5.3 KN-62阻斷了嗎啡對硫氧還蛋白表達的誘導45-46
• 2.5.4 PD98059阻斷了嗎啡對硫氧還蛋白的誘導46
• 2.6 小結(jié)46-49
• 第三章 嗎啡對CDK5表達的影響及其信號通路研究49-57
• 3.1 引言49-50
• 3.2 實驗方案50-51
• 3.3 實驗材料51
• 3.4 實驗方法51-52
• 3.4.1 細胞培養(yǎng)51
• 3.4.2 細胞排板與藥物刺激51-52
• 3.5 實驗結(jié)果52-54
• 3.5.1 嗎啡對PC12細胞內(nèi)CDK5表達的影響52-53
• 3.5.2 MK-801阻斷了嗎啡對CDK5的抑制53
• 3.5.3 KN-62阻斷了嗎啡對CDK5的抑制53-54
• 3.5.4 PD98059阻斷了嗎啡對CDK5的抑制54
• 3.6 小結(jié)54-57
• 第四章 嗎啡作用下Trx和p-CREB的相關(guān)性研究57-64
• 4.1 引言57
• 4.2 實驗方案57-58
• 4.3 實驗材料58
• 4.4 實驗方法58-60
• 4.4.1 Trx高表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染58-60
• 4.5 實驗結(jié)果60-62
• 4.5.1 不同劑量嗎啡作用下對CREB蛋白水平的影響60
• 4.5.2 不同劑量嗎啡作用下對p-CREB蛋白水平的影響60-61
• 4.5.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后PC12細胞中Trx的表達情況61
• 4.5.4 Trx高表達PC12細胞中p-CREB的表達情況61-62
• 4.6 小結(jié)62-64
• 第五章 嗎啡作用下Trx和NR2B的相關(guān)性研究64-72
• 5.1 引言64-65
• 5.2 實驗方案65-66
• 5.3 實驗材料66-67
• 5.3.1 實驗動物及耗材66
• 5.3.2 CPP實驗裝置66-67
• 5.4 實驗方法67-68
• 5.4.1 條件性位置偏愛實驗67-68
• 5.4.2 小鼠腦組織的制備68
• 5.4.3 組織蛋白的提取68
• 5.5 實驗結(jié)果68-70
• 5.5.1 CPP實驗結(jié)果68-69
• 5.5.2 嗎啡成癮小鼠海馬區(qū)NR2B蛋白的表達69
• 5.5.3 嗎啡成癮小鼠海馬區(qū)p-CREB蛋白的表達69-70
• 5.6 小結(jié)70-72
• 第六章 結(jié)論72-74
• 6.1 確定了PC12細胞中嗎啡誘導硫氧還蛋白表達的最佳作用劑量72
• 6.2 證明了PC12細胞中嗎啡誘導硫氧還蛋白表達的信號轉(zhuǎn)導通路72
• 6.3 證明了嗎啡作用PC12細胞中CDK5表達的信號轉(zhuǎn)導通路72
• 6.4 證明了嗎啡作用下硫氧還蛋白及p-CREB的相關(guān)性72-73
• 6.5 初步證明了硫氧還蛋白在一定程度上參與了嗎啡的成癮記憶73-74
• 致謝74-75
• 參考文獻75-81
• 附錄81-89

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1 崔泓,賈慧敏,張祖s，

本文編號：719008