本文關(guān)鍵詞：針對(duì)老年癡呆中Aβ42靶點(diǎn)的單鏈抗體及其分子機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默病 β-淀粉樣蛋白 單鏈抗體 神經(jīng)毒性 血腦屏障

【摘要】：阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s disease, AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其病理特征是漸進(jìn)性的Aβ42的聚集與沉積、神經(jīng)突觸丟失和神經(jīng)纖維纏結(jié)，臨床表現(xiàn)為記憶功能衰減及識(shí)別能力障礙，同時(shí)伴有各種神經(jīng)癥狀和行為障礙。對(duì)于AD的發(fā)病機(jī)理有多種觀點(diǎn)，其中普遍認(rèn)同的是Aβ42毒性學(xué)說(shuō)�，F(xiàn)已證明，由β-淀粉樣肽（Aβ42）單體聚集形成的Aβ42寡聚體是引起AD的主要致病因子。 有關(guān)AD的被動(dòng)免疫治療報(bào)道中，多數(shù)采用的是人源化的多克隆抗體或單克隆抗體，但這些抗體因分子大不易穿過(guò)血腦屏障或特異性差易引起副作用而限制了在臨床上的應(yīng)用。為克服這些限制，從構(gòu)建小分子人源性抗體或抗體片段出發(fā)，篩選特異性識(shí)別和結(jié)合Aβ42寡聚體的單鏈抗體成為目前診斷或治療AD的熱點(diǎn)。 本論文利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等方法，通過(guò)β-淀粉樣肽（Aβ42）抗原的構(gòu)象設(shè)計(jì)和組裝，利用Aβ42寡聚體為抗原特異性篩選，獲得抗Aβ42寡聚體的單鏈抗體（scFv）基因，并表達(dá)出該單鏈抗體。所獲得的單鏈抗體具有Aβ42寡聚體構(gòu)象靶向性高、分子小、易實(shí)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)運(yùn)等突出特點(diǎn)，并顯示出了用于治療和預(yù)防老年癡呆癥（或稱阿爾茨海默氏病，Alzheimer’s disease, AD）的有效性和可行性：（1）分離提取人外周血淋巴細(xì)胞，獲得外周血淋巴細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用PCR擴(kuò)增方法從人外周血淋巴細(xì)胞cDNA中獲得重鏈可變區(qū)VH及輕鏈可變區(qū)VL，進(jìn)一步以SOE-PCR方法獲得scFv基因。以pET41b為載體，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建單鏈抗體庫(kù)。（2）利用Aβ42寡聚體作為抗原篩選陽(yáng)性克隆，最后獲得了四株與抗原有較強(qiáng)結(jié)合的陽(yáng)性克隆。對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，將所測(cè)得的scFv基因序列與GeneBank中的免疫球蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，分析結(jié)果顯示所獲得的四個(gè)克隆均為編碼scFv的DNA序列，分別包含了編碼抗體重鏈可變區(qū)（VH）、輕鏈可變區(qū)（VL）的DNA序列。（3）通過(guò)Dot-blot及Western blot方法，證明了獲得的單鏈抗體能夠特異性識(shí)別Aβ42寡聚體。（4）通過(guò)間接ELISA方法，測(cè)定單鏈抗體對(duì)Aβ42寡聚體的結(jié)合力。結(jié)果顯示，測(cè)得四種單鏈抗體均可在稀釋度為0.625nM仍有結(jié)合能力，因此確定四種單鏈抗體均可在nM級(jí)別水平發(fā)揮作用。進(jìn)一步檢測(cè)了四種單鏈抗體的親和力常數(shù)KD，由KD值可以看出，獲得的單鏈抗體與Aβ42寡聚體具有較強(qiáng)的親和力。（5）ThT-F方法和電子顯微鏡觀察等實(shí)驗(yàn)方法分析得出獲得的單鏈抗體能夠抑制Aβ42的聚集或纖維化、并能夠誘導(dǎo)Aβ42聚集體解聚。（6）通過(guò)MTT及LDH釋放實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，四種單鏈抗體能夠明顯提高細(xì)胞存活率，并且其抑制Aβ42寡聚體對(duì)細(xì)胞的毒性作用呈濃度依賴性。然而，單鏈抗體對(duì)Aβ42單體及纖維抑制作用不顯著。進(jìn)一步分析單鏈抗體對(duì)Aβ42毒性作用的抑制和中和作用。結(jié)果顯示，四種單鏈抗體均具有抑制及中和Aβ42寡聚體及原纖維對(duì)細(xì)胞的毒性作用。并且，四種單鏈抗體的抑制Aβ42寡聚體及原纖維毒性作用均顯著于中和作用。（7）通過(guò)應(yīng)用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC及膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6進(jìn)行共培養(yǎng)的方法，建立體外血腦屏障模型，，檢測(cè)單鏈抗體跨血腦屏障得的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。結(jié)果顯示，四種單鏈抗體穿透血腦屏障隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加，并且在60min后穿透率達(dá)到峰值并呈現(xiàn)穩(wěn)定。 上述結(jié)果為設(shè)計(jì)和研制免疫預(yù)防與治療老年癡呆（或稱阿爾茨海默氏病，AD）的新型小分子抗體藥物提供了依據(jù)并奠定了基礎(chǔ)，作為臨床診斷和AD治療的免疫制劑具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 β-淀粉樣蛋白 單鏈抗體 神經(jīng)毒性 血腦屏障
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 緒論13-29
• 1. 阿爾茨海默病13
• 2. 臨床癥狀和神經(jīng)病理學(xué)13-15
• 3. APP切割及Aβ形成15-16
• 4. Aβ聚集及神經(jīng)毒性16-18
• 5. 遺傳因子和風(fēng)險(xiǎn)因子18-20
• 6. 淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)20-21
• 7. AD 的診斷和治療21
• 8. 構(gòu)象依賴性抗體21-22
• 9. 治療 AD 的 scFv22-29
• 9.1 人工scFv23-24
• 9.2 天然重鏈抗體24-25
• 9.3 scFv的腦轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制25-29
• 第二章 人源性的單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建、鑒定及抗 Aβ42 寡聚體特異性單鏈抗體的篩選29-47
• 引言29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-30
• 2.1.1 質(zhì)粒載體與菌株29
• 2.1.2 工具酶及主要試劑29-30
• 2.1.3 主要儀器30
• 2.2 方法30-40
• 2.2.1 外周血淋巴細(xì)胞 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA30-31
• 2.2.2 編碼 VH 與 VL 的 DNA 片段擴(kuò)增31-32
• 2.2.3 編碼 scFv 的 DNA 片段的拼接和擴(kuò)增32-33
• 2.2.4 編碼 scFv 的 DNA 片段與原核表達(dá)載體連接33-34
• 2.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）34
• 2.2.6 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化34
• 2.2.7 陽(yáng)性克隆的篩選34-35
• 2.2.8 單鏈抗體基因的 DNA 序列測(cè)定35
• 2.2.9 單鏈抗體的誘導(dǎo)表達(dá)35
• 2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）35-36
• 2.2.11 表達(dá)產(chǎn)物的純化36
• 2.2.12 蛋白印跡（Western blotting）36-40
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-45
• 2.3.1 人源性單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建40-42
• 2.3.2 陽(yáng)性克隆的篩選42-43
• 2.3.3 單鏈抗體的表達(dá)和制備43-45
• 本章小結(jié)45-47
• 第三章 抗 Aβ42 寡聚體特異性單鏈抗體的功能研究47-73
• 引言47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 3.1.1 細(xì)胞株47
• 3.1.2 試劑47
• 3.1.3 主要儀器47-48
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法48-55
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)48-50
• 3.2.2 Dot-blot 檢測(cè)單鏈抗體與 Aβ42 寡聚體的結(jié)合特異性50
• 3.2.3 Western blot 檢測(cè)單鏈抗體對(duì) Aβ42 寡聚體的識(shí)別50
• 3.2.4 單鏈抗體對(duì) Aβ42 寡聚體結(jié)合力的檢測(cè)50-51
• 3.2.5 單鏈抗體親和力常數(shù)的測(cè)定51-52
• 3.2.6 單鏈抗體對(duì) Aβ42 聚集的抑制作用52
• 3.2.7 透射電鏡觀察單鏈抗體對(duì) Aβ42 聚集過(guò)程及聚集體形態(tài)的變化的影響52
• 3.2.8 四唑鹽（MTT）法檢測(cè)單鏈抗體抑制 Aβ42 對(duì)細(xì)胞的毒性作用52-53
• 3.2.9 單鏈抗體對(duì) Aβ42 細(xì)胞毒性的抑制和中和作用53
• 3.2.10 LDH 法檢測(cè)單鏈抗體抑制 Aβ42 對(duì)細(xì)胞的毒性作用53-54
• 3.2.11 體外血腦屏障模型建立及單鏈抗體穿透血腦屏障的檢測(cè)54-55
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-72
• 3.3.1 Dot-blot 檢測(cè)四種單鏈抗體與 Aβ42 寡聚體的結(jié)合特異性的分析55
• 3.3.2 Western blot 檢測(cè)單鏈抗體對(duì) Aβ42 寡聚體識(shí)別的分析55-57
• 3.3.3 單鏈抗體對(duì) Aβ42 寡聚體結(jié)合力的檢測(cè)57
• 3.3.4 單鏈抗體親和力的測(cè)定57-59
• 3.3.5 單鏈抗體對(duì) Aβ42 聚集抑制作用的分析59-60
• 3.3.6 單鏈抗體對(duì) Aβ42 聚集抑制作用的形態(tài)學(xué)分析60-61
• 3.3.7 單鏈抗體抑制 Aβ42 對(duì)細(xì)胞的毒性作用61-65
• 3.3.8 單鏈抗體對(duì) Aβ42 細(xì)胞毒性的抑制和中和作用分析65-69
• 3.3.9 單鏈抗體抑制 Aβ42 毒性作用的細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析69-70
• 3.3.10 單鏈抗體跨體外血腦屏障模型效應(yīng)的分析70-72
• 本章小結(jié)72-73
• 討論73-78
• 全文總結(jié)78-79
• 參考文獻(xiàn)79-91
• 作者簡(jiǎn)介91
• 博士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果91-93
• 致謝93

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本文編號(hào)：700184