本文關鍵詞：神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的研究

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【摘要】：第一部分大鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染的實驗研究 目的 原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，并在體外繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞后，可做為移植的種子細胞，滿足細胞移植需要。 材料與方法 以健康孕15天Wistar大鼠為實驗動物，體外分離并原代培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，之后傳代培養(yǎng)，并進行單細胞克隆實驗。免疫熒光法和免疫組化SP法對神經(jīng)干細胞分進行鑒定，，Lentivirus介導轉(zhuǎn)染NSCs。 結果 1．原代培養(yǎng)細胞可形成數(shù)十個細胞聚集而成的小神經(jīng)球(Neurosphere)神經(jīng)球逐漸增大，7天時神經(jīng)球已生長成為數(shù)百個細胞的大克隆，即可傳代培養(yǎng)。傳代第7天時已再次長成為數(shù)百個細胞聚集的大克隆，將細胞連續(xù)傳代，細胞的生長模式基本相同。 2．原代培養(yǎng)的神經(jīng)球經(jīng)分散再擴增得到的大量神經(jīng)球呈nestin抗原陽性；神經(jīng)球可以分化為三種細胞，免疫熒光法和免疫組化SP法檢測三種細胞分別呈NSE、CNP、GFAP陽性。 3．慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染NSCs后，熒光顯微鏡下觀察，可見NSCs攜帶綠色熒光。 結論 1．從大鼠胚胎(孕15天)腦組織中分離的神經(jīng)干細胞在體外可繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，可滿足細胞移植需要。 2．慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞，標記后的神經(jīng)干細胞做為移植的種子細胞，便于在動物體內(nèi)進行跟蹤研究。 第二部分NSCs移植治療大鼠血管性癡呆的實驗研究 目的 將慢病毒介導GFP標記的NSCs通過海馬立體定向注射的方法移植到血管性癡呆模型大鼠，使海馬周圍的NSCs數(shù)量增加，用Morris水迷宮檢測系統(tǒng)對實驗大鼠作定位航行試驗和空間探索實驗測試，檢測大鼠的學習記憶能力的改變，觀察NSCs移植的治療效果。 材料與方法 月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來制備血管性癡呆2VO模型；傳代至第6代的Wistar大鼠神經(jīng)干細胞，GFP標記后于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對假手術組、對照組、NSCs移植組海馬組織切片做尼氏染色，觀察病理學改變；在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）時對移植前后各組大鼠行Morris水迷宮測試，對定位航行實驗和空間探索實驗結果進行統(tǒng)計分析。 結果 1．神經(jīng)干細胞移植1周后，大鼠海馬區(qū)冰凍切片顯示有綠色熒光存在，證明神經(jīng)干細胞可在海馬區(qū)域存活、增殖。 2．缺血4周時（移植前），NSCs移植組與對照組大鼠各項指標均無顯著性差異，但二者與假手術組相比均有顯著性差異。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）時，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期較對照組均明顯縮短（P0.05），但與假手術組相比仍明顯延長；NSCs移植組穿越平臺區(qū)次數(shù)較對照組也明顯增加（P0.05），與假手術組相比仍明顯減少(P0.01)；NSCs移植組大鼠平臺所在象限停留的時間百分比較對照組明顯增加（P0.05，移植后12周除外），但與假手術組相比仍明顯減少(P0.05)。 3．NSCs移植組尼氏染色顯示神經(jīng)元丟失、變性情況較對照組有明顯改善，神經(jīng)元細胞形態(tài)較完整，胞漿內(nèi)尼氏小體相對較豐富。 結論 神經(jīng)干細胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠學習記憶能力。 第三部分Notch通路在神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠中的作用研究 目的 檢測神經(jīng)干細胞移植對VaD大鼠海馬區(qū)Notch1及Hes1表達的動態(tài)改變，研究神經(jīng)干細胞移植對大鼠學習記憶能力的改善與海馬區(qū)Notch1、Hes1表達的變化是否相關，探討Notch信號通路是否參與了神經(jīng)干細胞移植對血管性癡呆大鼠模型的治療。 材料與方法 月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來制備血管性癡呆2VO模型；傳代至第6代的wistar大鼠神經(jīng)干細胞球，GFP轉(zhuǎn)染標記后做為移植的種子細胞，于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對假手術組、對照組、NSCs移植組腦組織海馬區(qū)蛋白樣品進行Western blot檢測。 結果 在缺血9周、13周、17周（移植后4周、8周、12周）的Western blot檢測檢測均提示NSCs移植組Notch1和Hes1表達水平較對照組高，有顯著性差異（P0.05），但與假手術組相比仍明顯較低（P0.05）；NSCs移植組3個時間點的Notch1和Hes1表達逐漸下降，呈時間依賴性。 結論 移植的NSCs激活了Notch1-Hes1通路，該通路可能參與NSCs移植對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的修復。 第四部分神經(jīng)干細胞移植治療對血管性癡呆大鼠突觸可塑性的影響 目的 研究神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的過程中是否存在樹突與樹突棘的形態(tài)和結構改變，血管性癡呆大鼠學習記憶能力的改善是否與樹突和樹突棘的形態(tài)和結構改變相關。 材料與方法 月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來制備血管性癡呆2VO模型；傳代至第6代的wistar大鼠神經(jīng)干細胞球，GFP轉(zhuǎn)染標記后做為移植的種子細胞，于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對假手術組、對照組、NSCs移植組腦組織海馬CA1區(qū)樹突的分支及樹突棘密度進行統(tǒng)計分析。 結果 血管性癡呆對照組及NSCs移植組樹突分支數(shù)目與假手術組相比均明顯減少，有顯著性差異，隨時間延長下降趨勢不明顯；NSCs移植組樹突分支數(shù)目與血管性癡呆模型對照組相比有所增加，有統(tǒng)計學意義（P0.05）。血管性癡呆大鼠模型組和NSCs移植組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度均明顯下降，有統(tǒng)計學意義（P0.05），NSCs移植組樹突棘密度與血管性癡呆模型對照組相比則有所增加，差距有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結論 神經(jīng)干細胞移植增加了血管性癡呆大鼠模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突的復雜性及樹突棘密度，這些改變可能與血管性癡呆大鼠學習、記憶能力的改善相關。
【關鍵詞】：神經(jīng)干細胞 傳代 GFP VaD大鼠 Morris水迷宮測試 尼氏染色 血管性癡呆大鼠 Notch1 Hes1 Western blot檢測 神經(jīng)干細胞移植 樹突 樹突棘
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.13
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 中英文縮略詞表15-16
• 第一部分 大鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及慢病毒介導 GFP 轉(zhuǎn)染的實驗研究16-32
• 1 引言16-17
• 2 材料與方法17-23
• 3 結果23-25
• 4 討論25-27
• 5 結論27-28
• 6 參考文獻28-29
• 7 附圖29-32
• 第二部分 NSCs 移植治療血管性癡呆大鼠的實驗研究32-50
• 1 引言32
• 2 材料與方法32-37
• 3 結果37-41
• 4 討論41-45
• 5 結論45-46
• 6 參考文獻46-48
• 7 附圖48-50
• 第三部分 Notch 通路在神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠中的作用研究50-65
• 1 引言50-51
• 2 材料與方法51-57
• 3 結果57-59
• 4 討論59-62
• 5 結論62-63
• 6 參考文獻63-65
• 第四部分 神經(jīng)干細胞移植治療對血管性癡呆大鼠突觸可塑性的影響65-80
• 1 引言65-66
• 2 材料與方法66-70
• 3 結果70-71
• 4 討論71-74
• 5 結論74-75
• 6 參考文獻75-79
• 7 附圖79-80
• 綜述1 腦部 Notch 信號通路的研究進展80-88
• 參考文獻86-88
• 綜述2 樹突棘結構可塑性與學習記憶88-102
• 參考文獻98-102
• 個人簡歷 在學期間發(fā)表的學術論文與研究成果102-104
• 致謝104

【參考文獻】

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本文編號：693915