發(fā)布時(shí)間：2017-08-14 00:16

  本文關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病突觸線粒體質(zhì)量控制機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)又稱老年性癡呆,是老年人群中最常見的神經(jīng)退行性病變之一。絕大多數(shù)的AD病例為散發(fā)病例,通常隱襲起病,緩慢、進(jìn)行性進(jìn)展。隨著全球范圍的人口老齡化問題越來越嚴(yán)重,AD作為與年齡相關(guān)疾病,患病率日益增長。線粒體功能障礙是AD發(fā)生發(fā)展過程中非常重要的機(jī)制之一,其線粒體質(zhì)量控制途徑受損,包括線粒體動(dòng)力學(xué)失衡、線粒體DNA損傷修復(fù)異常以及線粒體自噬異常等,是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。突觸線粒體功能障礙是AD早期病變之一,參與AD的突觸損傷機(jī)制。而這些改變都和與AD發(fā)展相關(guān)的p淀粉樣蛋白沉積密不可分。從AD腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)異常聚集的突觸線粒體以及線粒體自噬在異常線粒體移除中的重要作用中我們可以推論,AD相關(guān)的突觸線粒體功能障礙可能與突觸線粒體的線粒體質(zhì)量控制途徑受損有關(guān)。線粒體自噬是線粒體質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)之一,是指通過巨自噬作用選擇性的將受損的線粒體清除掉的過程,是維持細(xì)胞內(nèi)線粒體群體健康的一個(gè)非常重要的機(jī)制。線粒體自噬在進(jìn)化中非常保守,特異性地只去除受損的線粒體,對線粒體質(zhì)量控制進(jìn)行調(diào)節(jié)。具體的線粒體自噬的機(jī)制目前還不明了,現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin級(jí)聯(lián)反應(yīng)是神經(jīng)細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體自噬的主要途徑。研究表明,不管是在正常的神經(jīng)元功能維持中,還是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中,PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在維持線粒體質(zhì)量方面起著非常重要的作用,因此我們推論P(yáng)INK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在AD相關(guān)的受損突觸線粒體清除和大量功能異常線粒體聚集等病理機(jī)制中也起著至關(guān)重要的作用。AD腦內(nèi)線粒體DNA拷貝數(shù)的改變引起了我們對AD腦內(nèi)線粒體DNA質(zhì)量控制相關(guān)蛋白研究的興趣。A-SUCL-β蛋白是線粒體DNA質(zhì)量控制途徑相關(guān)蛋白,為琥珀酰輔酶A合成酶(Succinyl-CoA Ligase, SUCL)的p亞基之一。SUCL是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)酶,存在于線粒體基質(zhì)中,參與催化將琥珀酰輔酶A和ADP或GDP轉(zhuǎn)化為琥珀酰、輔酶A和ATP或GTP的可逆性反應(yīng),它是一個(gè)異構(gòu)二聚體,由一個(gè)固定的α亞基SUCL-a,和一個(gè)底物特異性的p亞基A-SUCL-β(由SUCLA2基因編碼)或G-SUCL-P(由SUCLG2基因編碼)組成,其中SUCL-a與A-SUCL-β結(jié)合可以合成ATP,與G-SUCL-β結(jié)合可以合成GTP。SUCLA2基因作為A-SUCL-p蛋白的編碼基因,其缺失或突變均可以導(dǎo)致線粒體DNA的缺失從而導(dǎo)致各種線粒體腦肌病的病理表現(xiàn)。并且研究發(fā)現(xiàn)A-SUCL-β蛋白特異表達(dá)于成熟的神經(jīng)元細(xì)胞中,在神經(jīng)元發(fā)育過程中起著重要作用。研究表明,這類線粒體疾病的主要病理特征為線粒體DNA拷貝數(shù)的減少,而其原因大多都是因?yàn)镾UCLA2基因的突變而導(dǎo)致琥珀酰輔酶A合成酶的活性降低所致。由于肌肉、腦、肝臟等器官耗能較高,所以線粒體DNA缺失主要表現(xiàn)為一組這些高耗能器官功能障礙等遺傳異質(zhì)性臨床特征,包括進(jìn)行性肌無力,腦病,心肌病,肝性腦病,通常伴有乳酸血癥等。發(fā)病一般在一歲以內(nèi),許多病例病死于兒童期早期�；贏D中存在的線粒體DNA損傷及缺失,以及A-SUCL-β蛋白與神經(jīng)元發(fā)育及線粒體DNA完整性的重要聯(lián)系,我們推測A-SUCL-β蛋白也可能參與了AD的發(fā)生發(fā)展過程。然而在AD的發(fā)生機(jī)制中有關(guān)A-SUCL-β蛋白的數(shù)據(jù)目前還是空白。研究目的1、研究AD相關(guān)突觸線粒體的功能障礙以及線粒體質(zhì)量控制途徑的損傷情況。2、研究A-SUCL-β蛋白參與AD突觸線粒體質(zhì)量控制的機(jī)制。研究方法1、動(dòng)物模型：我們通過AD模型小鼠-5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩非轉(zhuǎn)基因的對照組小鼠,每個(gè)雜交籠內(nèi)均放有一只5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠雄鼠與1到2只第一代背景鼠SJL雌鼠。實(shí)驗(yàn)用鼠均為雜交鼠第二代,理論上同窩出生的小鼠中5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因陰性的對照組小鼠比例為1：1。幼鼠生長至3周齡即分出母籠,打耳標(biāo)、剪尾,進(jìn)行基因型鑒定。2、非連續(xù)密度梯度離心提純小鼠大腦突觸線粒體：所有步驟均在4-C或冰上進(jìn)行。首先取出小鼠大腦皮層,加入5倍體積的線粒體分離液(mitochondrial isolation buffer, IB),在玻璃勻漿器內(nèi)勻漿約10次,1300g離心5分鐘。用IB稀釋Percoll至三種濃度(15%,23%和40%,體積／體積比,各2mL),在超速離心管中建立三層非連續(xù)濃度梯度,將上清緩慢置于三層非連續(xù)濃度梯度的Percoll分離液之上。34000g離心14分鐘。離心后,可見線粒體在離心管內(nèi)被分為三層。第一層為細(xì)胞內(nèi)破碎的膜結(jié)構(gòu)。第二層(15%和23%Percoll之間)為突觸小體,第三層(23%和40%Percoll之間為非突觸線粒體。將第二層取出后,分別加入20mL含0.02%地高辛的1B,混勻后冰上靜置5分鐘,進(jìn)一步破碎突觸小體的膜結(jié)構(gòu)釋放出突觸線粒體。16500g離心15分鐘。取出沉淀,加入1mLIB重懸后再8000g離心10分鐘。取出沉淀重懸后重復(fù)第2步非連續(xù)濃度梯度的Percoll離心。取出離心后第三層即為純化的突觸線粒體,加1B重懸后再清洗一遍,16500g15分鐘、8000g 10分鐘離心。沉淀即為突觸線粒體。沉淀加入適量IB重懸線粒體后加入蛋白酶抑制劑,蛋白定量后用于實(shí)驗(yàn)或-80。C儲(chǔ)存以備之后使用。3、Westernblot免疫印跡：將樣本進(jìn)行蛋白濃度測定,通過濃度體積計(jì)算后將各樣本濃度調(diào)節(jié)至一致,加入已含還原劑p-ME的蛋白上樣緩沖液后,混勻,沸水加熱10分鐘。將樣本冷卻至室溫后,數(shù)秒離心將樣本聚集至管底后混勻,按等體積上樣至膠的加樣孔內(nèi)。電壓120V電泳約1到2小時(shí)后,停止電泳。轉(zhuǎn)膜所用PVDF膜使用前需甲醇預(yù)處理。轉(zhuǎn)膜120V,90至100分鐘(視目標(biāo)蛋白大小而定)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜,室溫干膜后用甲醇再處理至膜半透明狀態(tài)。將膜放入封閉液中(TBS配置的5%脫脂牛奶),室溫孵育1小時(shí)。按適當(dāng)?shù)谋壤?%脫脂牛奶配置一抗,40C一抗孵育過夜。TBS室溫洗三遍后,按適當(dāng)?shù)谋壤?%脫脂牛奶配置二抗,室溫二抗孵育1小時(shí)。TBS室溫再洗三遍后,將膜置于ECL中顯像,通過凝膠成像系統(tǒng)對信號(hào)進(jìn)行采集,使用ImageJ進(jìn)行條帶處理及分析。4、新生小鼠大腦原代神經(jīng)元培養(yǎng)：取出新生鼠大腦,在預(yù)冷的D-Hank's緩沖液中將大腦皮層分離出后去腦膜,分離出皮層或海馬組織后,在新的含預(yù)冷D-Hank's緩沖液的離心管中再潤洗一遍。皮層組織需要在分離后在預(yù)冷的培養(yǎng)皿中用刀片迅速切成細(xì)小的碎片。將預(yù)熱至37℃的胰酶約等體積至兩倍體積加入組織中,37℃水浴15分鐘,每5分鐘混勻一次。加入1mL胎牛血清終止胰酶反應(yīng)�；靹蚝蟮冉M織沉至管底后將上清盡可能多的取出,加入相同體積的D-Hank's緩沖液,用吸管緩慢勻速吹打約20到30次,將消化好的組織吹散。將吹打混勻后的細(xì)胞懸液過篩后200g離心5分鐘,去上清后,加入適量的培養(yǎng)液(Neurobasal A,2% B27,0.5mM左旋谷氨酰胺),細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后按所需密度種入已經(jīng)包被好多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中。培養(yǎng)中的原代神經(jīng)元需約每3-4天換半液。5、線粒體DNA基因擴(kuò)增：建立PCR體系(20μL體系,含0.4ug線粒體蛋白,一對引物各200nM, dNTP Taq DNA多聚酶,2μL 10X PCR緩沖液)；PCR循環(huán)(23個(gè)循環(huán)：94℃30秒,55℃ 30秒,72℃40秒)；擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離后EB染色顯像。6、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：Westernblot圖像和PCR圖像由BioRad公司ImageLab圖像處理系統(tǒng)采集,由美國國家衛(wèi)生院ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度處理及分析,將目標(biāo)蛋白灰度值以相應(yīng)線粒體內(nèi)參蛋白或細(xì)胞總蛋白內(nèi)參蛋白調(diào)整處理后,將對照組數(shù)值設(shè)置為1,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。熒光免疫染色數(shù)據(jù)由尼康共聚焦顯微鏡自帶圖像分析軟件采集并導(dǎo)出,數(shù)據(jù)分析通過ImageJ軟件處理分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,通過兩組間T-Test分析或多組間ANOVA方差分析,p0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn)。研究結(jié)果1、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體功能障礙的研究我們通過熒光免疫染色發(fā)現(xiàn)4月齡和8月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的腦內(nèi)均有Aβ沉積增多。并且我們將小鼠腦內(nèi)突觸線粒體提純,通過Western blot免疫印跡及ELISA檢測證實(shí)8月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中有大量的Ap沉積,4月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中Ap沉積不明顯。通過4-HNE染色對脂類氧化進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)在5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元中4-HNE染色顯著增加,且有大量染色與胞體以及突起中的線粒體標(biāo)記重合,提示神經(jīng)元線粒體功能障礙和神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激增加相關(guān)。同時(shí),mtDNA基因擴(kuò)增數(shù)據(jù)顯示,4月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸線粒體中mtDNA拷貝數(shù)無明顯變化；而8月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸線粒體中mtDNA拷貝數(shù)比對照組明顯降低(p=0.02)同時(shí)我們通過Western blot免疫印跡結(jié)果證實(shí)5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白表達(dá)失衡。8月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中的Mfn2表達(dá)量相比對照組顯著降低(p0.01)；同樣,OPA1表達(dá)量也顯著降低(p=0.005),而5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中的Dlpl表達(dá)量相比對照組顯著升高(p=0.001),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體自噬途徑功能障礙的研究研究結(jié)果顯示,8月齡的5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠有大量的Parkin易位到突觸線粒體上,而其對照組突觸線粒體中Parkin水平則很低(p0.001)。然而兩組之間大腦皮層勻漿中Parkin總表達(dá)量沒有明顯的差異。突觸線粒體上的PINK1含量和大腦皮層勻漿中總PINK1的含量兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)與對照組相比,8月齡5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的突觸線粒體中的P62水平明顯升高；然而在大腦皮層勻漿中的P62水平兩組間沒有顯著差異。同樣,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中的LC3顯著增加(p0.001),提示5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)更多的突觸線粒體被LC3標(biāo)記,線粒體自噬小體的形成增加。我們進(jìn)一步通過5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠及對照組小鼠大腦皮層切片的電鏡掃描圖片觀察到,5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)元的突觸部位有大量的包含著線粒體的囊狀小體聚集,即線粒體自噬小體。提示AD突觸線粒體的線粒體自噬小體形成增多,但移除受阻。3、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中A-SUCL-β蛋白的相關(guān)研究我們發(fā)現(xiàn)與各自相應(yīng)年齡的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾?4月齡的5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中A-SUCL-β蛋白含量降低,約25%(p=0.03)；8月齡的5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中A-SUCL-β蛋白含量也降低,約28%,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.02)。提示在AD發(fā)病早期即有A-SUCL-β的改變。與4月齡的非轉(zhuǎn)基因小鼠相比,8月齡非轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中A-SUCL-β蛋白含量也有降低趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.13),表明A-SUCL-β降低并不是僅年老所致。而4月齡和8月齡的5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦勻漿內(nèi)的A-SUCL-β蛋白含量均無明顯變化,表明5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的A-SUCL-β蛋白含量降低是神經(jīng)元特異的。4、A-SUCL-p表達(dá)下調(diào)與Ap毒性相關(guān)關(guān)系的研究我們使用Ap寡聚體處理非轉(zhuǎn)基因C57小鼠的原代培養(yǎng)神經(jīng)元,來建立Ap毒性神經(jīng)元細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,1州的Ap寡聚體處理后的原代培養(yǎng)神經(jīng)元中A-SUCL-β表達(dá)量較對照組降低(p=0.003)。然而,單純的H202處理后的神經(jīng)元內(nèi)A-SUCL-β表達(dá)量無明顯變化,表明單純氧化應(yīng)激并不能導(dǎo)致神經(jīng)元中A-SUCL-β表達(dá)量下調(diào)。5、SUCLA2敲除／敲入細(xì)胞模型線粒體功能障礙的研究我們使用293T細(xì)胞進(jìn)行SUCLA2基因敲除(SUCLA2-KO)及SUCLA2基因敲入(SUCLA2-KI)兩種基因修飾。Western blot數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,與對照組細(xì)胞相比,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI細(xì)胞中的OPA1的表達(dá)量均有不同程度的升高,約2到3倍,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；而Mfn2表達(dá)量無明顯變化。另外,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI細(xì)胞中的D1pl都比對照組高,1.5倍左右,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)另外我們也檢測了Parkin誘導(dǎo)線粒體自噬途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)量,如Parkin、 PINK1、LC3等。結(jié)果顯示,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI細(xì)胞中的Parkin表達(dá)量均比對照組高,約1.6到1.8倍；與此相反的是與對照組細(xì)胞相比,SUCLA2-KO和SUCLA2-KI細(xì)胞中的PINK表達(dá)量卻明顯降低。SUCLA2-KO細(xì)胞中的LC3表達(dá)量比對照組高3倍多,SUCLA2-KI細(xì)胞中的LC3表達(dá)量比對照組高2倍,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論1、Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑受損是AD突觸線粒體質(zhì)量控制非常重要的環(huán)節(jié),其中AD突觸線粒體自噬被強(qiáng)烈地活化,然而線粒體自噬小體的移除受阻可能更多地參與了AD相關(guān)的突觸線粒體功能障礙的病理發(fā)展過程。2、A-SUCL-β在AD突觸線粒體中含量降低,與突觸線粒體中Aβ沉積相關(guān),且在突觸線粒體質(zhì)量控制功能障礙中起重要作用。3、我們的研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡述了AD突觸線粒體質(zhì)量控制途徑受損的機(jī)制,提示了線粒體質(zhì)量控制的調(diào)節(jié)將是未來潛在的AD治療新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 突觸線粒體 線粒體自噬 Parkin A-SUCL-β
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• ABSTRACT14-20
• 符號(hào)說明20-22
• 中文版學(xué)位論文22-92
• 前言22-32
• 1、線粒體結(jié)構(gòu)與功能22-23
• 2、阿爾茨海默病及其線粒體病理機(jī)制23-27
• 3、阿爾茨海默病的突觸線粒體功能障礙與線粒體質(zhì)量控制27-30
• 4、線粒體DNA缺失與琥珀酰胺A合成酶30-32
• 材料和方法32-41
• 1、主要儀器32-33
• 2、動(dòng)物模型的培養(yǎng)與雜交33
• 3、試驗(yàn)方法及相關(guān)試劑33-40
• 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析40-41
• 研究結(jié)果41-49
• 1、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體功能障礙的研究41-43
• 2、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體自噬途徑功能障礙的研究43-45
• 3、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠突觸線粒體中A-SUCL-β蛋白的相關(guān)研究45-46
• 4、5xFAD轉(zhuǎn)基因小鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元中A-SUCL-β蛋白的研究46
• 5、A-SUCL-β表達(dá)量的下降與Aβ毒性相關(guān)關(guān)系的研究46-47
• 6、SUCLA2基因敲除/敲入細(xì)胞模型線粒體功能障礙的研究47-49
• 討論49-56
• 結(jié)論56-58
• 附圖58-75
• 參考文獻(xiàn)75-84
• 綜述84-92
• 參考文獻(xiàn)89-92
• 英文版學(xué)位論文92-154
• Introduction92-104
• 1.1 The structure and function of mitochondria92-94
• 1.2 Alzhdmer's disease and its mitochondrial pathogenesis94-98
• 1.3 Mitochondrial dysfunction and quality control of AD98-102
• 1.4 Mitochondrial DNA depletion syndrome and succinyl-CoA synthetase102-104
• Materials and Methods104-112
• 1. Equipments104-105
• 2. Breeding of 5xFAD transgenic mice105
• 3. Protocols105-112
• Results112-119
• 1. Synaptic mitochondrial dysfunction in 5xFAD transgenic mice.112-114
• 2. Dysfunction of mitophagy pathway in AD synaptic mitochondria114-116
• 3. Less A-SUCL-P in synaptic mitochondda of SxFAD transgenic mice116
• 4. Less A-SUCL-p in primary cultured neurons of SxFAD transgenic mice116-117
• 5. The association between A-SUCLr-β and Ap toxicity117-118
• 6. Research about SUCLA2 KO/KI293T cells118-119
• Discussion119-126
• Conclusion126-128
• Figures128-145
• Reference145-154
• 致謝154-155
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文155-156
• 附錄156-174
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表174

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本文編號(hào)：669768