發(fā)布時(shí)間：2017-08-13 15:31

  本文關(guān)鍵詞：過(guò)表達(dá)人tau蛋白對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的影響

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【摘要】：背景：神經(jīng)炎癥在阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease, AD)及其他tau蛋白病的病理進(jìn)程中發(fā)揮著基礎(chǔ)性的作用。在AD腦的病理易損區(qū)域明顯存在著炎癥反應(yīng),這種炎癥過(guò)程是由小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的,小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,它是大腦固有免疫系統(tǒng)的組成部分。tau蛋白異�？梢砸鹕窠�(jīng)退行性疾病,在轉(zhuǎn)人突變型tau蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與tau蛋白的沉積是相關(guān)聯(lián)的,在轉(zhuǎn)人錯(cuò)誤折疊的截短tau蛋白的轉(zhuǎn)基因鼠中也發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活。盡管現(xiàn)在已經(jīng)有人tau蛋白模式轉(zhuǎn)基因鼠,但tau蛋白的細(xì)胞毒性作用及其機(jī)制卻不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中,我們研究了人tau蛋白的一種亞型,人最長(zhǎng)tau亞型tau40(human tau40, htau40)的局部表達(dá)是否能誘導(dǎo)發(fā)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及這種炎癥反應(yīng)的機(jī)制,我們利用表達(dá)人tau40蛋白的腺相關(guān)病毒為載體,使小鼠腦內(nèi)局部區(qū)域感染人tau40病毒,從而觀察人tau40蛋白對(duì)神經(jīng)元的毒性作用,并探討了這種毒性作用與神經(jīng)炎癥之間的關(guān)系。 目的：研究htau40的毒性作用與神經(jīng)炎癥之間的關(guān)系。 方法：采用腦立體定位注射技術(shù)使小鼠海馬齒狀回區(qū)(dentate gyrus, DG),紋狀體(striatum)和內(nèi)嗅皮層(entorhinal cortex, EC)感染AAV-ctrl或AAV-htau40病毒；用激光共聚焦顯微鏡觀察AAV-htau40對(duì)神經(jīng)突(neurite)的損傷；采用taul與微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein2, MAP2)抗體確定神經(jīng)突的損傷存在于樹(shù)突還是軸突;采用CD68(cluster of differentiation68)抗體與膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillaryacidic protein, GFAP)抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況；采用taul及pS396抗體檢測(cè)htau40感染區(qū)域tau蛋白的磷酸化情況；采用高爾基染色檢測(cè)樹(shù)突棘的形態(tài)數(shù)量的改變；采用離體腦片電生理技術(shù)檢測(cè)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)的改變；采用水迷宮以及條件恐懼實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改變；采用transwell以及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)N2a/wt轉(zhuǎn)htau40細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力的影響；采用ELISA技術(shù)檢測(cè)N2a/wt轉(zhuǎn)htau40質(zhì)粒之后以及原代皮質(zhì)神經(jīng)元感染／AAV-htau40之后炎癥相關(guān)分子的水平的改變； 結(jié)果：(1) AAV-htau40的感染可以引起神經(jīng)突的損傷,且這種損傷存在于軸突當(dāng)中；(2)AAV-htau40的感染顯著激活了小膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞；(3)AAV-htau40的感染損傷了樹(shù)突棘的正常形態(tài)以及數(shù)量,減弱了神經(jīng)元的突觸可塑性；(4)AAV-htau40的感染增強(qiáng)了tau蛋白的磷酸化；(5) htau40造成樹(shù)突棘的損傷以及LTP的抑制。(6) AAV-htau40造成動(dòng)物行為學(xué)上的漸進(jìn)性損傷；(7) htau40的條件培養(yǎng)基在體外可以促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力；(8) htau40損傷的神經(jīng)元可能通過(guò)釋放趨化因子CX3C配體1(Chemokine (C-X3-C motif) ligand1, CX3CL1),腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)以及白介素-6(Interleukin6, IL-6)等來(lái)激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；(9)免疫抑制劑FK506能夠減弱由AAV-htau40感染造成的小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。 結(jié)論：(1)炎癥過(guò)程參與了htau40的毒性作用；(2) htau40的毒性作用是由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的；(3)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及軸突的退化,突觸的損傷是htau40病理的早期事件。 我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn),磷酸酪氨酰磷酸酶激酶(Phosphotyrosyl phosphatase activator, PTPA)的蛋白水平在阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)病人腦內(nèi)以及AD轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)下降。本研究中,我們探討了PTPA的下調(diào)是否會(huì)影響細(xì)胞的存活及其相關(guān)的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)PTPA可定位于線粒體膜上,在HEK293和N2a細(xì)胞系中下調(diào)PTPA引起凋亡。PTPA下調(diào)可降低線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP),誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位到線粒體膜上,誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放到胞漿中,激活caspase-3從而引發(fā)PARP的剪切,且引起B(yǎng)cl-2和Bcl-xl蛋白水平的下降。過(guò)表達(dá)PP2A催化亞基(PP2A catalytic subunit, PP2AC)并不能逆轉(zhuǎn)由下調(diào)PTPA誘導(dǎo)的凋亡,下調(diào)PTPA不影響MAPKs激酶的磷酸化水平,表明PP2A以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)并沒(méi)有參與到下調(diào)PTPA誘導(dǎo)的凋亡中。在過(guò)表達(dá)tau的細(xì)胞中,下調(diào)PTPA可抑制PP2A活性,從而誘導(dǎo)tau蛋白的過(guò)度磷酸化,但并不引起細(xì)胞的凋亡,這些數(shù)據(jù)表明下調(diào)PTPA可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,但tau的過(guò)度磷酸化可以逆轉(zhuǎn)由PTPA誘導(dǎo)的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默癥 人tau40 神經(jīng)炎癥 膠質(zhì)細(xì)胞 PTPA 凋亡 阿爾茨海默癥 細(xì)胞色素C
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• Part Ⅰ 過(guò)表達(dá)人tau40導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和膠質(zhì)細(xì)胞炎癥5-54
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-23
• 結(jié)果23-42
• 討論42-46
• 小結(jié)46
• 創(chuàng)新點(diǎn)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• Part Ⅱ 過(guò)表達(dá)人tau40對(duì)抗PTPA基因下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡54-81
• 摘要54-55
• Abstract55-56
• 前言56-57
• 材料與方法57-62
• 結(jié)果62-73
• 討論73-75
• 小結(jié)75
• 創(chuàng)新點(diǎn)75-76
• 參考文獻(xiàn)76-81
• 綜述81-96
• 參考文獻(xiàn)88-96
• 附錄一 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況96-97
• 附錄二 攻讀學(xué)位期間參加國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議情況97-98
• 附錄三 攻讀學(xué)位期間參與國(guó)家自然基金98-99
• 致謝99-100

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本文編號(hào)：668028