本文關(guān)鍵詞：胞外三磷酸腺苷在淀粉樣蛋白β誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中的功能和機(jī)制研究

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【摘要】：阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,嚴(yán)重危害了中、老年人的生活質(zhì)量,而隨著全球老齡化的到來(lái),其發(fā)病人數(shù)逐年增加,對(duì)社會(huì)所造成的危害也日益加劇。AD患者的記憶、認(rèn)知、學(xué)習(xí)能力呈現(xiàn)漸進(jìn)式的衰退且不可逆轉(zhuǎn),生活自理能力逐漸喪失,多數(shù)病人最終死于感染。AD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確,但淀粉樣蛋白β(amyloid β, Aβ)在AD中的核心作用是受到廣泛認(rèn)同的。AD發(fā)生過(guò)程中,Ap過(guò)量表達(dá),形成寡聚物以及不溶性的Ap纖維逐漸沉積為斑塊,最終形成老年斑。大量的老年斑作為病灶,產(chǎn)生神經(jīng)毒性,是AD的重要病理特征。然而,Aβ的神經(jīng)毒性機(jī)制十分復(fù)雜,目前仍然無(wú)法完整解釋。因此,Aβ細(xì)胞毒性機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn),并且對(duì)于AD的診斷以及治療具有重大意義。為探討Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的分子機(jī)制,實(shí)驗(yàn)中采用Neuro-2a細(xì)胞和小鼠原代大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞建立了Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型,通過(guò)MTT細(xì)胞活性檢測(cè)、顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察、Hoechst熒光染色、TUNEL檢測(cè)等多種方法,研究不同濃度Aβ25-35對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞活性與存活的影響。結(jié)果顯示,Aβ25-35能夠造成神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞活性降低,表現(xiàn)為濃度依賴(lài)性。Aβ25-35能夠引起N2a細(xì)胞形態(tài)改變,出現(xiàn)分化、變小、細(xì)胞破碎等現(xiàn)象；原代皮層神經(jīng)細(xì)胞在Aβ的作用下出現(xiàn)突觸斷裂丟失,胞體變小、皺縮等細(xì)胞損傷表現(xiàn),并且出現(xiàn)較多凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明,Aβ25-35能夠引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷。據(jù)報(bào)道神經(jīng)系統(tǒng)損傷釋放的核苷酸可能參與介導(dǎo)細(xì)胞的損傷,胞外核苷酸包括ATP、 ADP、UTP、UDP及其衍生物。為探究Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷是否與胞外核苷酸有關(guān),本文在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中先用胞外核酸酶Apyrase處理細(xì)胞后,再加入Aβ25-35刺激N2a細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)Apyrase加入后,相對(duì)于Aβ25-35單獨(dú)刺激組,Apyrase處理細(xì)胞的活性有所回升,說(shuō)明胞外核苷酸可能參與了神經(jīng)細(xì)胞損傷。我們進(jìn)一步用不同濃度ATP、ADP、UTP、 UDP直接刺激N2a細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有3、5、10mmol/L等高濃度的ATP會(huì)引起N2a細(xì)胞活性顯著的下降,并且存在濃度依賴(lài)。顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察、Hoechst熒光染色、TUNEL檢測(cè)的結(jié)果也證實(shí)了這個(gè)現(xiàn)象。隨后我們利用生物素?zé)晒夥▽?duì)Aβ25-35刺激N2a以及N9細(xì)胞上清中的ATP進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Aβ25-35能夠引起N2a神經(jīng)細(xì)胞和N9小膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP,并且具有時(shí)間依賴(lài)性。通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Aβ25-35刺激N2a細(xì)胞后,作為ATP的受體P2X7表達(dá)上調(diào)。我們進(jìn)一步利用P2X7受體抑制劑BBG預(yù)處理神經(jīng)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Aβ25-35及ATP引起的細(xì)胞損傷得到顯著的緩解。說(shuō)明胞外ATP是通過(guò)與P2X7受體結(jié)合,在Ap引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用的。最后,通過(guò)熒光定量PCR與蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Aβ通過(guò)胞外ATP引起的神經(jīng)損傷,在細(xì)胞內(nèi)是通過(guò)激活BAX表達(dá),并且引起Caspase-3激活以及剪切實(shí)現(xiàn)的。提示我們ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑,引起Caspase-3激活而引起的。綜上所述,Aβ25-35能夠引起ATP釋放,胞外ATP與神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上P2X7受體結(jié)合后,引起下游BAX、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白激活,進(jìn)而造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。而P2X7受體抑制劑BBG能夠部分阻斷Aβ25-35引起的神經(jīng)損傷。本文為Aβ的細(xì)胞毒性機(jī)理研究提供了新的思路,也為P2X7受體作為AD治療靶點(diǎn)的研究提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茲海默癥 淀粉樣蛋白β 神經(jīng)細(xì)胞損傷 三磷酸腺苷 P2X7受體
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一章 Aβ可以明顯誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損傷14-29
• 1 引言14-15
• 2 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 3 實(shí)驗(yàn)方法16-19
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-26
• 5 分析與討論26-29
• 第二章 胞外ATP在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷發(fā)揮重要作用29-44
• 1 引言29-30
• 2 實(shí)驗(yàn)材料30
• 3 實(shí)驗(yàn)方法30-32
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-42
• 5 分析與討論42-44
• 第三章 Aβ通過(guò)胞外ATP引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的信號(hào)通路44-71
• 1 引言44-45
• 2 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 3 實(shí)驗(yàn)方法46-50
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-68
• 5 分析與討論68-71
• 全文總結(jié)71-73
• 綜述73-80
• 1 阿爾茲海默癥73-75
• 2 Aβ與阿爾茲海默癥75-77
• 3 P2X7受體在阿爾茲海默癥中的功能77-80
• 參考文獻(xiàn)80-86
• 附錄86-87
• 致謝87

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本文編號(hào)：653324